제주지역 참진드기(Acari: Ixodidae) 분포조사 및 Haemaphysalis 종에 대한 Rickettsia 병원체 동정과 계통발생학적 분석

Abstract

본 연구를 통해 제주지역에서 채집된 진드기는 참진드기과(family Ixodidae), 피참진드기속(genus Haemaphysalis)에 속하는 개피참진드기(Haemaphysalis flava)와 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis) 등 2종이었다. 조사기간 동안 총 72개 지점에서 3,089개체가 채집되었는데, 그 중 H. flava 3개체, 그리고 나머지 3,086개체는 모두 H. longicornis 였다. 또한 H. longicornis는 조사지점 모두에서 채집되었으나, H. flava는 3개 지점(동경 126° 33′ 29.0″, 북위 33° 25′ 36.4″, 동경 126.17′ 15.8″, 북위 33° 20′ 32.8″, 동경 126° 27′ 45.7″, 북위 33° 20′ 56.8″)에서 각각 1개체씩 3개체가 드물게 채집되었다. H. longicornis종의 발육 단계에 따른 계절별 채집 비율을 보면, 성충 암컷의 경우에는 4월부터 8월까지 채집되었지만 5월과 6월을 제외하고는 점차적으로 증가하였다. 성충 수컷은 4월부터 8월까지 점진적인 증가를 나타내었으며, 자충은 전 조사기간에 걸쳐 다른 발육 단계의 개체보다 훨씬 높은 채집 비율을 보이면서 5월에 최고치를 나타내었다. 그리고 유충은 8월에 나타나기 시작하였다. 제주지역에서 수집한 총 1,395마리의 H. longicornis 진드기를 대상으로 16S rRNA 유전자에 기초한 nested PCR을 시행하여 Anaplasma와 Ehrlichia 종의 감염존재를 확인하였다. 진드기 매개 병원체들을 검출하기 위한 PCR 방법에서 주형 DNA는 506개의 진드기 풀(pools)에서 추출하여 실험에 이용하였다. PCR 증폭산물의 염기서열분석에 의해 8개의 Anaplasma 속과 6개의 Ehrlichia 속이 동정되었다. Nested PCR과 염기서열분석에 의해 동정된 유전종들의 분포는 A. phagocytophilum이 27(1.9%)개로 가장 우세하게 분포하였고 다음으로 5개(0.4%)의 A. bovis, 4개(0.2%)의 E. chaffeensis, 1개(0.1%)의 A. centrale순이었다. 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 계통발생학적 분석에서 8개의 Anaplasma 속(상동성, 99.4% 이상)은 GenBank database에 있는 A. marginale 균종들(AF309867, AF414874, FJ226454)과, 6개의 Ehrlichia 속(상동성, 99.5% 이상)은 Ehrlichia sp. (DQ324547)와 가장 높은 유사성을 보였다. 3개의 Anaplasma 유전종인 A. phagocytophilum (A group), A. bovis (B group), A. centrale (genotype C), 그리고 1개의 Ehrlichia 유전종인 E. chaffeensis (D group)는 GenBank database에서 Anaplasma와 Ehrlichia 관련된 염기서열들과 비교하여 동정하였다. A group에 속하는 27개의 A. phagocytophilum 클론(clone)들은 7개의 유전형(genotype)으로 분류되었다. 특히, 염기서열이 일치하는 3개의 클론을 포함하는 genotype A6는 미국에서 승인된 A. phagocytophilum (AY055469)과 일치하였다. 반면에 A1, A2, A3, A4 genotype들의 염기서열 범위는 99.6% 이상으로 매우 높은 상동성을 나타냈다. genotype B2는 한국에서 승인된 A. bovis와 99.7%로 아주 높은 상동성을 보였고, genotype D1은 GenBank database에서 미국(M73222), 중국(AF147752), 한국(AY350424)에서 승인된 E. chaffeensis 균주들과 99.7%의 높은 상동성을 나타내었다. 이러한 결과로 보면 제주도 지역의 자연환경에서 가장 많이 분포하는 H. longicornis 진드기에서 동정된 A. phagocytophilum (genotype A1-A7)은 거의 모든 조사지역에서 편재하였고, 고유의 진드기 매개 병원체인 리켓치아 유전형들이 염기서열 결정과 계통발생학적 분석을 통하여 평가되었다. 채집된 진드기에서 발육단계별로 진드기들을 총 250개로 pooling하여 DNA를 추출하여 홍반열군(Spotted fever group) 리켓치아에 특이하게 반응하도록 제작한 ompB, gltA, 17 kDa antigen 프라이머를 이용하여 nested PCR을 수행하였다. 250개의 시료 중 224개의 시료(90.7%)에서 ompB-PCR 양성 산물을 확인하였으며, 224개의 시료 중에서 26개의 시료를 선별하여 gltA, 17 kDa antigen PCR을 수행한 결과, 각각 26개(100%), 25개(96.2%)의 시료에서 양성 반응을 보였다. PCR 산물들을 클로닝하여 GenBank database에서 얻은 다양한 리켓치아 염기서열과 비교한 결과 ompB, gltA와 높은 유사성을 나타내었다.

This study investigates the geographical distribution and the presence of nucleic acids of various rickettsial agents of ticks collected in Jeju Island from the year 2007 to 2008. A total of 3,089 ticks (3,086 of Haemaphysalis longicornis and three of Haemaphysalis flava) was collected at 72 sites by dragging and flagging method. By developmental stage, H. longicornis adult and lymph were collected from April to August. On the contrast, H. longicornis larva was collected only on August. By monthly distribution, The number of H. longicornis adult increased steadily from April to August but there was no difference by monthly except for May and June. H. longicornis lymph collected from April to August and peaked on May. H. longicornis larva was collected and started to appear on August. A total of 1,395 H. longicornis tick collected from Jeju Island were examined by 16S rRNA gene-based nested PCR for the presence of infectious Anaplasma and Ehrlichia species. Template DNAs to detect the tick-borne pathogens were prepared from a total 506 tick pools. Eight Anaplasma and six Ehrlichia species by 16S rRNA gene PCR and sequencing analysis were identified. A. phagocytophilum was most prevalent (27, 1.9%) by nested PCR, followed by A. bovis (5, 0.4%). E. chaffensis (4, 0.2%), and A. centrale (1, 0.1%). In the phylogenetic analysis based on 16S rRNA sequences, eight species of Anaplasma group (>99.4% homology) and six species of Ehrlichia group (>99.5% homology) were close to deposited A. marginale strains (AF309867, AF414874, and FJ226454) and Ehrlichia sp. (DQ324547), respectively. Three Anaplsma species; A. phagocytophilum (group A), A. bovis (group B) and A. centrle (group C), and one Ehrlichia species; E. chaffcensis (group D) were determined by comparing with Anaplasma and Ehrlichia related sequences. First, twenty-seven A. phagocytophilum clones belong to group A were divided into 7 genotypes. The sequence similarity among genotypes A1 to A4 was very high (>99.6%). Genotype B2 was close to A. bovis from Korea (99.7%). Genotype D1 was close to known E. chaffcensis strains (M73222, AF147752, and AY350424) and their similarity value was 99.7%. In conclusion, A. phagocytophilum identified in predominant H. longicornis ticks were ubiquitous throught the Jeju Island. The various tick-mediated infectious rickettsia have been found through DNA sequence and phylogenetic analysis. A total of 1,584 ticks were examined the presence of nucleic acids of various rickettsial agents in ticks collected in Jeju Island, Korea from the year 2007 to 2008, through the nested polymerase chain reaction (PCR) and sequencing analysis of partial citrate synthase (gltA), Rickettsia outer membrane protein B (ompB), and 17 kDa antigen genes. Examination of the 1,584 ticks showed that the species distribution of H. longicornis was 99.81% (n=1,581) and H. flava was 0.91% (n=3). A total of 224 out of 250 pools containing one to 15 ticks were found positive in ompB-PCR assay. From the positive samples, 26 were analysed by gltA- and 17 kDa antigen PCR assays. The nucleotide sequences of the ompB- and gltA-PCR products showed a high degree of similarity to those of the R. japonica (98.7～99.2% and 98.7～99.3%, n=25) and R. monacensis (99% and 99.7%, n=1). However, analysis of the nucleotide sequences of the 17 kDa antigen PCR amplicons showed that the sequences of the 25 PCR amplicons are more close to R. marmionii (99.4～100%) than R. japonica (98.6～99.1%). These findings suggest that various rickettsial diseases could be transmitted via the bite of tick vectors in Jeju island, Korea.