어병예방제 사용가능성을 위한 수용성키토산의 항균성 연구

Abstract

양이온잔기가 많이 분포된 키토산은 음전하로 하전된 물질을 흡착하는 성질을 갖고 있어 박테리아 및 중금속을 억제하는데 탁월한 효과가 있다. 분자량과 항균성은 상관관계가 없다는 선행연구를 토대로 제작비용이 저렴하고 간편한 수용성 고분자 키토산을 제조하여 손쉽게 수족관 관리를 할 수 있는 새로운 어병예방제로의 활용 가능성을 확인하였다. 본 연구에서는 2%의 아세트산에 키토산분말(Showa co. Japan)을 녹인 후 중화반응을 거쳐 pH6.0의 수용성 고분자 키토산을 제작하였고, 이를 토대로 어병 관련 박테리아(Aeromonas, Salmonella, Vivrio, Edwardsiella 속) 9가지를 대상으로 in vitro test를 통해 항균성효과를 조사하였다. in vitro test는 Paper disc method 및 microplate을 이용한 항균성을 테스트, CFU 측정의 방법으로 진행하였다. in vitro test에서 의미 있는 효과가 있는 균주를 대상으로 in vivo test를 진행하였다. 제브라피쉬를 대상으로 키토산 농도별 생존조건, 어류질병박테리아 감염 조건, 감염된 제브라피쉬에 대한 질병 예방효과를 실험하였다. Microplate에서 O.D 0.05, 200㎕의 배양균주에 각 농도의 키토산 20㎕를 투여하여 3일간 흡광도를 측정한 생장억제 테스트 결과 키토산 농도 0.1～0.01%에서 4종의 박테리아 균주(Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Staphylococcus aureus, Salmonella enteric)에 대해 생장억제효과가 있었다. 항균성 효과가 있었던 4가지 균주를 대상으로 in vivo test 중 감염조건을 조사한 결과 200ml의 메디아병에 O.D600nm= 1.0의 Aeromonas hydrophila를 10㎖ 접종한 실험군에서 제브라피쉬가 2일이내에 사망하여 대략적인 감염 기준으로 설정하였다. 감염조건 설정 이후 20분간 균주를 키토산에 노출시켜 CFU를 통해 0.0001%와 0.0005%에서 약90% 이상의 균주의 생장을 억제하는 키토산의 강력한 항균성을 재확인하였다. 제브라피쉬를 이용한 14일간의 감염예방효과실험을 통해 Aeromonas hydrophila 2 O.D, 0.00005% 농도의 키토산처리 실험군에서 제브라피쉬가 대조군에 비해 14일 중 2일 이상 더 생존한 것으로 미루어 감염예방효과가 있음을 확인할 수 있었다. 평상시 어항관리에 키토산을 적용한다면 물고기 생존에 적합한 농도인 0.00001%를 정기적으로 투여하는 방식으로 관리를 하고, 물의 오염정도가 높은 경우 0.00005%를 투여해준다면 키토산이 박테리아의 생장을 억제하여 낮아진 박테리아의 개체수에 대해서는 물고기가 자체면역으로 질병을 극복하고 건강하게 살 수 있을 것이라 예측할 수 있다. 뿐만아니라 키토산은 중금속 및 불소를 흡착하여 물고기 생존에 적합한 수질개선효과도 더불어 볼 수 있을 것이다.

Previous studies have confirmed that positively charged chitosan can bind to negatively charged bacterial cell wall. In this regards both low and high-molecule types of chitosan has shown antibiotic effect against various pathogenes. In our study, we have made a high-molecule weight chitosan solution and investigated the antibacterial effects by in vitro tests. It was revealed that chitosan solution can reduce the fish disease bacteria population release in water tank. In vitro test, using microplate method showed that chitosan has a distinguish mark on depopulation of bacteria. But it is difficult to apply to all bacteria such as Vivrio ichyventery. The exact reason for this is not yet revealed and there is no relation either the bacteria is Gram positive or negative. In vivo study we have determined the appropriate infection condition of bacteria into zebrafish. Comparing induced chitosan solution (treatment group) with no induced control group showed that new way of prevent to fish disease just one dose treatment to the tanks. However, present data suggest that application of chitosan in fish disease treatment is not suitable for healing the wounds. Therefore, we suggest that antibacterial activity of water-soluble chitosan as effective treatment for fish disease. We certificate antibacterial activity on fish disease strains through in vitro test. And if we use chitosan solution with predetermined concentration that the macro-molecule soluble chitosan can use a preophylactic natural medicine. This research provides insights into a novel approach of fish disease control with less labor and lower cost. Therefore, addition of chitosan into fish culturing tanks would be an excellent method to control the disease as well as to maintain the higher water quality of aquarium