Development of multivalent vaccines and establishment of an immunization program to prevent parasitic, bacterial, and viral diseases in Korean olive flounder aquaculture

Abstract

국내 넙치 양식 산업은 시장가격 하락으로 인한 낮은 이익, 다양한 질병으로 인한 높은 폐사율, 종묘 열성화 등 여러가지 문제점에 직면해 있다. 이 중 질병 문제는 양식산업에 직접적으로 영향을 주며 큰 경제적 손실을 초래하기 때문에 해결해야할 최우선 과제로 꼽히고 있다. 국내 총 넙치 생산량의 60% 이상을 차지하는 제주 지역 넙치의 폐사량은 2010년 5,601톤에서 2019년 10,634톤으로 약 2배가 증가하였으며 질병으로 인한 넙치의 피해금액은 약 1,300억/년으로 추정된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 항생제 및 포르말린을 비롯해 다양한 화학적제제가 사용 중이나 항생제 내성균의 출현 및 식품안전 문제가 계속적으로 문제시되고 있어 백신접종이 필수불가결한 대안으로 제시되고 있다. 국내 넙치 양식 현장에는 기생충성, 세균성, 바이러스성 질병이 복합적으로 감염되고 있다. 하지만 기존 상용화된 백신은 세균성 질병 예방에만 편중되어 있다. 또한 현장에서 발생하는 질병을 제대로 반영하지 못하고 면역보조제가 첨가되어 있지 않아 백신 투여 시 효능이 낮은 실정이다. 그리고 넙치의 성장단계별 백신 접종의 항목, 투여시기 및 방법들에 관한 백신접종 메뉴얼의 부재로 인하여 실제 어민들이 백신을 사용함에 있어 높은 효능을 기대하기 어렵다. 본 연구에서는 양식 넙치에 빈번하게 발생하는 스쿠티카병, 활주세균병 비브리오병, 에드워드병, 연쇄구균병 및 바이러스성출혈성패혈증 예방이 가능한 3종의 다가 복합 백신을 개발하여 실험실과 양식현장에서 유효성 평가를 실시하였고 백신 접종 프로그램을 제시하였다. 제1장에서는 제주도내의 20개의 넙치양식장을 대상으로 2015년 2월부터 2020년 3월까지 스쿠티카병의 원인체인 Miamiensis avidus에 대한 기생충성 질병 모니터링을 실시하였다. 총 188개의 M. avidus를 확보하였고 PCR 분석, Cox1 유전자 염기서열 분석, 계통분류학적분석을 실시하였다. 그 결과, M. avidus 혈청형 I (JJB 1403)과 M. avidus 혈청형 II (JJC 1404)가 각각 79.3%, 20.7% 비율로 확인되였다. 이를 기반으로 하여 면역보조제를 첨가한 M. avidus 두 혈청형과 Tenacibaculum maritimum 예방이 가능한 3가 기생충성 세균성 복합 백신을 개발하였다. 백신의 유효성 평가를 위해 실험실 조건과 양식현장에서 백신접종 후 상대생존율을 확인하였다. 그 결과 실험실(상대생존율: 66%-87%)과 양식 현장(상대생존율: 76.38%)에서 모두 높은 효능을 확인하였고 항체 역가 또한 비접종군 대비 높은 수준을 유지하는 것을 확인하였다. 본 백신은 국내 최초 기생충성 및 세균성 질병 예방 백신으로 품목허가(제381-수산0001호)를 취득하였다. 제2장에서는 주사백신접종이 불가능한 넙치 치어를 대상으로 한 침지복합백신을 개발하여 효능 최적화를 실시하였다. M. avidus (혈청형 I, II), T. maritimum, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum 과VHSV 로 인한 질병 예방이 가능한 6가 기생충성 세균성 바이러스성 복합 백신을 개발하여 부스터 백신 접종의 유무, 항원 농도, 침지 시간, 항원 조합에 따른 효능 비교를 실시하였다. 그 결과, 5 g 미만의 넙치 치어에 유효성이 있는5가 기생충성 세균성 침지 복합 백신(상대생존율: 41%-53%)과 바이러스성 침지 단가 백신(상대생존율: 41%)을 개발하였다. 제3장에서는 넙치 성어에 지속적으로 피해를 주고 있는 Streptococcus parauberis 병원체에 대한 혈청형 모니터링을 실시하였고 Streptococcus parauberis 다혈청형 8가 세균성 바이러스성 복합 백신을 개발하였다. 전장 유전체 분석, PCR, 항 혈청 응집반응, western-blotting기법을 통해 1년간 제주도내 20개 넙치 양식장을 대상으로 분리한 S. parauberis의 혈청형 분석을 실시하였다. 그 결과 총 54개의 S. parauberis 분리 균주 중 S. parauberis I-3가 21개, S. parauberis I-4가 9개, S. parauberis I-4는 24개로 분포하는 것을 확인하였다. 이를 기반으로 하여 S. parauberis 3종, T. maritimum, Edwardsiella tarda, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum, VHSV를 항원으로 하는 8가 세균성 바이러스성 복합 백신을 개발하였고 높은 효능(상대생존율: 80-100%)을 확인하였다. 마지막 4장에서는 전 장에서 개발한 5가 기생충성 세균성 침지 복합 백신, 3가 기생충성 세균성 복합 백신, 8가 세균성 바이러스성 복합 백신을 넙치의 성장단계별로 접종한 후 유효성 평가를 실시하였다. 그 결과, 실험실 (상대생존율: 50-100%)과 양식현장(상대생존율: 64.98%)에서 높은 유효성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 백신 접종군이 대조군보다 높은 증체량을 보였고 6개월간 높은 항체 역가를 유지하였다. 따라서 본 연구 결과를 토대로 하여 양식 넙치 백신 접종 프로그램을 제시하였다. 본 백신 접종 프로그램을 넙치 양식 현장에 적용시 약 60% 이상의 폐사율 저감이 가능하며 질병 치료를 위해 사용되는 항생제 및 포르말린 사용량을 약 50% 이상 저감할 수 있으리라 생각된다. 또한 다가 복합 백신 접종을 통한 접종 횟수 최소화로 다양한 질병을 예방할 수 있을 뿐 아니라 접종비용 절감, 어류 스트레스 완화 및 성장률 및 생존율 향상 등의 효과도 기대할 수 있다.

Olive flounder, Paralichthys olivaceus has been the topmost cultured finfish in South Korea for more than 10 years. However, with the expansion in the scale of aquaculture, the Korean aquaculture industry has been facing several problems, such as low profit due to lower market price, high mortality due to various diseases, and degradation of broodstock quality. Among these, solving the problem related to diseases is of utmost importance, which would also directly influence the aquaculture profit because of the reduction in diseases causing economic loss and the improvement of broodstock quality. Currently, antibiotics and formalin are used to reduce the mortality due to diseases. However, repetitive and excessive use of chemical therapeutics leads to serious problems such as the emergence of drug-resistant pathogenic bacteria and food safety and environmental issues. Vaccination is a robust alternative method to prevent diseases without any public health concerns. Several fish vaccines have been developed to prevent diseases under laboratory conditions. However, most approved fish vaccines in Korea are not only targeted specifically against bacterial diseases but are also unable to cope with the emergence of new diseases or serotypes. In addition, the lack of systematic and scientific data on the effects of vaccines in large-scale aquaculture, considering field conditions and efficacy and safety of the vaccines, makes the use of vaccines on a practical scale difficult. In this thesis, multivalent vaccines to prevent parasitic, bacterial, and viral diseases were developed and their efficacies were evaluated using large-scale field tests. In chapter I, we describe our investigation of the pattern of emergence of different Miamiensis avidus serotypes in 20 olive flounder farms in Jeju island, South Korea, from 2015 to 2020. A total of 188 isolates were detected from February 2015 to March 2020 (M. avidus serotype I [JJB 1403]: 149 strains; M. avidus serotype II [JJC 1404]: 39 strains). Based on the data derived by serotyping, a trivalent parasitic and bacterial vaccine to prevent scuticociliatosis and tenacibaculosis was developed. The efficacy of the vaccine was monitored for 21 days under laboratory conditions and for 12 weeks under large-scale field conditions. We observed a high relative percentage of survival rate (RPS) in the laboratory (66%–87%) and large-scale field trials (76.38%), along with a high-level and sustained antibody titer in vaccinated fish. In chapter II, we focused on our aim to optimize the efficacy of a hexavalent parasitic, bacterial, and viral immersion vaccine against parasitic, bacterial, and viral diseases caused by M. avidus (serotypes I and II), Tenacibaculum maritimum, Vibrio harveyi, V. anguillarum, and viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV). We evaluated the efficacy of the immersion vaccine based on different parameters affecting vaccination: booster vaccination, antigen concentration, immersion time, and antigen combination. The challenge test results revealed that vaccination for 30 s with booster vaccination methods without VHSV antigen (RPS: 41%–53%) was effective in providing good protection for juvenile olive flounder. VHSV monovalent vaccine showed higher protection when treated as a single antigen (RPS: 41%). In this chapter, we described that the flounder (1–5 g in weight) can be effectively protected against scuticociliatosis, tenacibaculosis, vibriosis, or VHSV infection, which usually cause critical damage in juvenile flounder. Altogether, these vaccines may be feasible for use in a hatchery setting using standard vaccination protocols. In chapter III, the intensive monitoring of Streptococcus parauberis has been described. A total of 54 S. parauberis isolates were found, among which 21 S. parauberis I-3, 9 S. parauberis I-4, and 24 S. parauberis I-5 were identified through subserotyping (full genome sequencing, anti-serum agglutination, western blotting, and polymerase chain reaction). An octavalent bacterial and viral vaccine to prevent diseases due to three different subserotypes of S. parauberis, T. maritimum, Edwardsiella tarda, V. harveyi, V. anguillarum, and VHSV was developed. A high RPS was observed under laboratory conditions (80%–100%), along with a high-level antibody titer in vaccinated fish. The pentavalent parasitic and bacterial immersion vaccine, trivalent parasitic and bacterial vaccine, and octavalent bacterial and viral vaccine were injected into the flounder growing under laboratory conditions and field trials, as described in chapter IV. A high RPS (50%–100%) was observed in vaccinated fish under laboratory conditions (4 weeks after trivalent and octavalent vaccination). In the field trial, a high RPS (final RPS: 64.98%, RPS for scuticocilatosis/tenacibaculosis: 64.59%, and RPS for streptococcosis: 91.71%) along with a high-level and sustained antibody titer was observed in vaccinated fish. Moreover, the weight of the flounder subjected to the immunization program was higher than that of the control fish. Altogether, this immunization program may be a good strategy to prevent parasitic, bacterial, and viral diseases efficiently. If this immunization program is applied to Korean olive flounder aquaculture, the mortality rate of the cultured olive flounder can be expected to be reduced by more than 60%. Moreover, the use of antibiotics and formalin can be reduced by 60%. In addition, the prevention of various diseases by minimizing the number of vaccinations leads to the reduction of injection costs and lower stress in cultured olive flounder.