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Anticoagulant and Anticancer Activities of Sulfated Polysaccharides Purified from Ecklonia cava and Grateloupia filicina

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Abstract
제주 연안에 대량으로 자생하는 감태(Ecklonia cava)와 지누아리(Grateloupia filicina)로부터 해조 기능성 다당류를 분리하고 정제하여 항혈액응고활성과 항암활성을 검토하였다. 해조류 다당류 추출은 시판되고 있는 식품용 당분해 효소로 해조류 조체의 세포벽을 분해하여 원심분리 후 상층액으로 알코올 침전법을 이용하였다. 이들 해조 다당류를 음이온교환 크로마토그래피(DEAE-cellulose)와 겔여과 크로마토그래피(sepharose-4B)로 항혈액응고 활성 물질을 순수 분리 하였다.
감태에서 분리한 황산화 다당류는 fucose 함량이 약 82%를 차지하고 있으며, 갈락토오스는 약 14%, 그리고 총당에 대한 황 함량비는 0.95인 후코이단인 것으로 밝혀졌다. 감태에서 순수 분리한 황산화 다당류로 혈액의 응고 지연 시간을 측정하여 항혈액응고 활성을 검토한 결과는, 감태 유래 항혈액응고 물질 (Ecklonia cava anticoagulant; ECA) 농도가 2배에서 시판 항혈액응고제인 헤파린과 아주 유사한 결과를 나타내었다. ECA는 activated coagulation factor assay로 검토한 결과, serine proteases II, X 및 VII의 생리학적인 저해 활성(serine protease에 의해 응고활성이 활성화가 되는데 감태 다당류가 serine proteases와 결합함으로서 혈액 응고를 방해한다)으로 응고 단계반응을 강하게 억제시켜 항혈액응고 활성을 나타낸다는 사실이 밝혀졌다. 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface Plasmon resonance)으로 ECA/ATIII (antithrombin-III)와 혈액응고 인자인 VIIa (FVIIa), factor Xa (FXa), thrombin (FIIa) 결합친화력과 kinetic을 분석한 결과는, KD 값이 FVIIa에서 15.1, FXa에서 45, FIIa에서는 65 nM로 나타났다(ECA와 ATIII가 먼저 결합을 하여 결합친화력을 증가시켜 응고를 활성화 시키는 serine protease와의 결합을 유도하여 응고 활성을 억제시킴). 이러한 결과를 종합해 볼 때, 감태에서 순수 분리한 다당류는 외래 요인과 공통 응고 경로 모두에서 ATIII를 매개하여 혈액응고를 저해하는 활성을 증가시킨다는 것을 확인 하였다. ECA는 in vitro 상에서 높은 항혈액응고 활성을 나타낼 뿐만 아니라 내피세포(ECV-304)에서 독성을 나타내지 않아, in vivo 상에서 항혈액응고 활성을 알아 보기 위하여 rat에 경구 투여한 결과, 시판 항혈액응고제인 헤파린과 동일한 농도에서 항혈액응고 활성을 나타냈으며, 대조구보다 아주 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 ECA는 높은 항혈액 응고활성을 가지고 있다는 사실이 명백하게 밝혀져 향후 천연 항혈액 응고제로서 개발이 가능할 것으로 판단된다.
지누아리에서 순수 분리한 항혈액응고 다당류(Grateloupia filicina anticoagulant: GFA)는 galactose 함량이 98%이고 총당에대한 황산기의 함량비가 0.42인 황산화 갈락탄인 것으로 밝혀졌으며, 분자량은 약 1,357 kDa을 가지고 있었다. 지누아리에서 순수 분리한 황산화 갈락탄의 항혈액응고 활성을 검토한 결과는, activated partial thrombin time (APTT)와 thrombin time (TT)에서 긍정적인 항혈액응고 활성을 나타내었다. GFA는 단백질과 당의 상호 작용에 의한 응고 반응 단계에서 factor X가 92%, factor II가 82% 및 factor VII이 68% 항혈액응고 활성을 나타내었으며, 여기서도 감태 유래 ECA와 마찬가지로 ATIII에 의해서 항혈액응고 활성이 증가하였다. GFA는 serine proteins과 혈전 응집과정에서 지속적으로 결합하여 응고를 감소시켰고, SPR 결과는 FXa (58.9 nM), FIIa (74.6 nM), 그리고 FVII (109.3 nM)로 각각 나타났다.
독성이 거의 없는 해양 유래 천연 다당류의 장점은 제약 공정에서 부작용을 줄일 수 있어 유리하게 작용할 수 있지만, 아직까지 해조류 유래 다당류를 이용한 항혈액응고 기전에 대한 명확한 연구가 진행되지 않아, 현재로서 당장 제약시장에서 상용화 될 수는 없지만 향후 충분한 가능성이 있을 것으로 판단된다.
높은 항혈액응고 활성을 갖는 감태에서 분리한 황산화 다당류인 ECSP가 항암효과를 가지는지 알아보려고 대표적인 시판 황산화 다당류인 fucoidan과 비교하여 여러 종류의 암세포에 대한 항암효과를 비교하였다. ECA는 대체적으로 암세포 증식을 억제 하였고, U-937과 HL-60에서 뛰어난 암세포 증식 억제 활성을 나타내었다. 특히 U-937 세포에서는 36.2 µg/ml로 fucoidan (43.9 µg/ml) 보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제 활성이 나타낸 것을 확인 할 수 있었다. apoptosis 유도 활성에서는 ECA를 15 µg/ml와 30 µg/ml로 세포에 각각 처리하였을 때에 sub G1 함량이 매우 높아 암세포에 대한 사멸효과는 apoptosis 유도에 기인하는 것으로 판단된다. 또한 혈액암세포인 U-937에 ECA를 24시간 동안 반응 시켰을 때 ECA의 농도가 증가할수록 DNA fragmentation이 증가하여 암세포 억제 활성을 보였다.
항암활성에 의한 다당류의 메커니즘을 확인하려고 caspase-7, caspase -8, Bax, Bcl-xL 및 PARP등의 항체를 이용하여 Western blot을 수행하였다. 그 결과는caspase -7와, caspase -8 및 PARP 경로에 의해 절단된 단백질을 확인 하였고, 이러한 절단 단백질에 의하여 apoptosis가 유도되었다는 것을 예측 할 수 있었다. 이와 함께 Bax와 Bcl-xL과 같은 세포 수송분자를 조절한 것을 확인 할 수 있었다. 모든 결과를 종합해 볼 때 황산화 다당류는 세포증식억제 효과를 통하여 apoptosis를 유도한 것으로 예측된다. 따라서 신호전달 경로와 연관된 다당류에 의한 apoptosis에 대한 연구는 더 필요하다.
Seaweeds collected from the sea shores of Jeju Island of Korea were enzymatically digested to prepare the extracts and investigated for their anticoagulant activity in several blood coagulation assays namely, activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT) and prothrombin time (PT). Of the investigated algal species, the enzymatic extracts of Ecklonia cava (brown alga) and Grateloupia filicina (red alga) showed a promising anticoagulant activity. The selected enzymatic extract of each algal species was applied on DEAE-cellulose (anion exchange chromatography) and Sepharose-4B (gel filtration chromatography) to purify the active compound.
The highly sulfated (0.95 sulfate/total sugar) anticoagulant polysaccharide (ECA), purified from E. cava was mainly composed of fucose (82%), galactose (14%) and small amount of mannose and xylose with 0.01% yield. The purified compound strongly interferes with coagulation cascade by inhibiting biological activity of serine proteases II, X and VII. The binding affinity between ECA/ATIII (antithrombin-III) and blood coagulation factors was in the order of VIIa (FVIIa) > factor Xa (FXa) > thrombin (FIIa) and the kinetics analysis elucidated that the KD values of ECA for FVIIa, FXa, and FIIa were 15.1, 45.0 and 65.0 nM, respectively. Therefore, the sulfated polysaccharide purified from the enzymatic extract of E. cava strongly enhance antithrombin III (ATIII) mediated coagulation factor inhibition selectively (FVII, FX, and II) in both of the extrinsic and common coagulation pathways. This may contribute for its high anticoagulant activity in vitro, and low cytotoxicity of ECA on venous endothelial cell line (ECV-304) expands its value in the future studies in vivo. The in vivo anticoagulant activity of ECA was investigated in Wistar rats and compared the results with that of heparin. Even though, the result of ECA was relatively lower than that of the commercial compound like heparin at the same concentration, but was quite stronger than that of saline alone treated sample. Therefore, as a natural anticoagulant compound ECA will be a promising candidate for future drug discovery in pharmaceutical industry.
Sulfated galactan isolated from Grateloupia filicina (0.42 sulfate/total sugar) possessed approximately 1,357 kDa molecular weight and composed mainly of galactose 98% and 1-2 % of glucose. The purified G. filicina anticoagulant (GFA) showed a potential anticoagulant activity on anticoagulant assays such as APTT and TT. GFA inhibited the coagulation factor X (92%), factor II (82%) and factor VII (68%) of the coagulation cascade, the molecular interaction (protein-polysaccharide) was highly enhanced with the presence of ATIII. The dissociation constant of polysaccharide towards serine proteins decreased in the order of FXa (58.9 nM)> FIIa (74.6 nM)> and FVII (109.3 nM) respectively. The low/less cytotoxicity of the polysaccharide benefits its use in pharmaceutical industry, however further studies which would help us to elucidate the mechanism of its activity are needed to address.
A sulfated polysaccharide purified from a brown alga, E. cava (ECSP) having high anticoagulant activity was investigated for its antiproliferative effect on several cancer cell lines and compared the effect with that of the commercial fucoidan. The sample had remarkable inhibitory effects against some selective tumor cell growth, especially its effect on human leukemic monocyte lymphoma cell line (U-937) and human promyelocytic leukemia cell (HL-60) was promising. The IC50 value of ECSP on U-937 was 43.9 µg/ml. The presence of the sample in the U-937 cell culture stimulated the induction of apoptosis as it was revealed by nuclear staining with Hoechst 33342. Moreover, the apoptosis induction was confirmed by the cell cycle analysis, clearly a pronounced sub G1 phase arrest was observed when the cells were treated at 15 µg/ml and 30 µg/ml. To rule out action mechanism of the polysaccharide for its anticancer activity, a western blot analysis was conducted with antibodies like caspase -7, caspase -8, Bax, and Bcl-xL. Taken together, it can be assumed that cleaved caspase-7 and 8 promoted PARP cleavage and they are directly responsible for the apoptosis induced by ECSP on U-937 cells. Moreover, it was revealed that ECSP sample regulated the Bax and Bcl-xL signals appropriately and contributed to control the normal U-937 cell growth.
Above results clearly demonstrate the possibility of algal polysaccharide for their potential application in pharmaceutical industry. However, further structural and functional studies on the sulfated polysaccharides isolated from the two seaweeds tested in this study are needed to utilize them successfully.
Author(s)
Yasantha Athukorala
Issued Date
2007
Awarded Date
2007. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000004148
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 해양생물공학과
Advisor
Jeon,You-Jin
Table Of Contents
BACKGROUND 1

PART I: Anticoagulant activity of sulfated polysaccharide purified from E. cava: an in itro and in vivo study 5
ABSTRACT 6
INTRODUCTION 8
MATERIALS AND METHODS 11
Algae samples and reagents 11
Digestion of algae samples 11
Molecular weight fractionation of algal extracts 12
Crude polysaccharide separation 12
Anion-exchange chromatography 12
Gel filtration chromatography 13
Agarose gel electrophoresis 13
Polyacrylamide gel electrophoresis 16
Determination of the molecular weight of the sample 16
IR-spectrum study 16
Field emission electron microscopic study 16
Neutral sugar analysis 17
Sulfate content analysis 17
Blood coagulation assays 17
Determination of specific factor assay 18
Surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy 18
Cytotoxicity assay 19
Ex vivo determination of anticoagulant activity on Wistler rats 20
Tail transaction bleeding time 21
Statistics 21
RESULTS AND DISCUSSION 22

PART II: Evaluation of biomolecular interactions of sulfated polysaccharide isolated from Grateloupia filicina on blood coagulation factors 69
ABSTRACT 70
INTRODUCTION 71
MATERIALS AND METHODS 73
Algae samples and reagents 73
Enzymatic extraction of G. filicina 73
Crude polysaccharide separation 74
Anion-exchange chromatography 74
Gel filtration chromatography 75
Agarose gel electrophoresis 75
Molecular weight determination 75
Neutral sugar analysis 75
Sulfate content analysis 76
Blood coagulation assays 76
Determination of specific factor assay 77
SPR binding studies 77
Cytotoxicity assay 78
RESULTS AND DISCUSSION 80

PART III: Anticancer activity of sulfated polysaccharide isolated from Ecklonia cava 103
ABSTRACT 104
INTRODUCTION 105
MATERIALS AND METHODS 107
Purification of the sulfated polysaccharide of E. cava 107
Assessment of the cell viability 107
Nuclear staining with Hoechst 33342 108
Flow cytometry analysis 108
DNA gel electrophoresis (DNA laddering) 109
Western blot analysis 109
RESULTS AND DISCUSSION 111

REFERENCES 131
ACKNOWLEDGEMENT 144
APPENDIX 147
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교
Citation
Yasantha Athukorala. (2007). Anticoagulant and Anticancer Activities of Sulfated Polysaccharides Purified from Ecklonia cava and Grateloupia filicina
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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