Antioxidant and Anticancer Activity of Extracts from Dangyuja (Citrus grandis Osbeck) Leaves Produced in Jeju Island

Abstract

지구상 대부분의 생명체는 공기 중의 산소를 호흡하여 산화시켜 얻어지는 에너지를 이용하여 생명을 유지하는데, 이런 산소가 필요한 대사과정에서 불가피하게 세포를 파괴시키는 독성물질들이 부산물로 만들어지는데 이것을 활성산소라고 한다. 활성산소는 생체 조직을 공격하여 세포를 산화, 손상시키는 주범이며 유해산소라고도 한다.활성산소는 세포나 세포소기관에 손상을 초래하기도 하며 생체 내 여러 단백질의 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능 저하를 초래한다. 핵산에도 손상을 주는데 핵산 염기의 변형, 핵산 염기의 유리, 결합의 절단, 당의 산화 분해 등을 초래하여 돌연변이나 암의 원인이 되기도 한다. 이로 인해 우리 몸이 노화되고 손상되는 것을 막아주는 물질을 항산화제 (antioxidants) 라고 한다. 항산화제는 인체 내에 자연적으로 존재하는 것과 외부에서 투여해 주는 것으로 나눌 수 있다. 인체 내에 자연적으로 존재하는 항산화제로는 SOD, glutathione, peroxidase 등의 효소와 요산, 빌리루빈 등이 있으며 외부에서 투여해 주는 것으로 비타민 E, C, 베타카로틴이 있으며 미네랄 중에는 셀레니움이 대표적이다. 이들 항산화제들은 활성 산소의 독작용을 제거하여 생체를 보호하고 있으며 항산화 물질이 활성산소를 적절히 제거하지 못할 경우 축적되는 활성산소에 의해 여러 가지 질병이나 노화가 초래된다고 알려져 있다. 과일과 채소의 섭취는 여러 가지 암의 발생률을 낮춘다는 역학조사가 많이 보고되고 있다. 과일이 질병을 억제 하는 이유 중의 하나는 여러 가지 영양 성분 중의 하나인 비타민 C와 E가 있기 때문인 것으로 알려져 왔으나 최근의 연구들은 항산화 역할을 하는 것은 비타민뿐만 아니라 과일에 많이 들어 있는 폴리페놀화합물, 플라보노이드류 등이라는 것이 보고되고 있다. 당유자는 제주에서 왕귤 또는 뎅유지라고 불리우며, 인체에 기능성을 가지는 성분으로 limonene, obacunone, nomiline, naringin 등을 함유하고 있는데, 특히 limonoid 성분이 다량 함유되어 있어 암세포 증식 억제 및 예방에 효과가 있고, 임상실험 결과 간, 폐, 장, 피부암 억제에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 당유자는 쓴맛과 향기가 강하여 당 절임한 당유자청 등을 이용한 음료에 이용되어 왔고, 주로 과육만 이용하는 다른 감귤류와는 달리 과육과 과피를 모두 이용하는 과일이므로 과피 부분에 많이 함유되어 있는 생리활성 성분을 귤이나 오렌지 같은 과일보다 용이하게 섭취할 수 있는 장점을 가지고 있다. 당유자 껍질은 두텁고 맛은 달며, 독이 없고 위 속에 악기를 없애며 술독을 풀어주고 입맛을 좋게 하는 것으로 알려져 있으며, 최근 당유자 추출물을 이용한 실험에서 항바이러스 효과 및 항산화 효과가 있는 것으로 보고되었다. 특히 당유자 미숙과에는 성숙되었을 때에 비하여 비타민 C 함량은 적지만, citric acid가 2배 이상 높아 상큼한 맛을 낼 수 있고, 항알러지 작용 및 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 flavonoid 성분인 naringin이 5배, hesperidin이 10배 더 많은 것으로 보고되었다. 민간에서는 과즙을 다려서 복용하면 위장장애, 천식 동맥경화 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 당유자의 과육, 과피에 대한 연구는 되어 있으나 잎에 대한 연구는 아직 없으며, 이러한 활성 및 그 기전에 대한보고 또한 없는 실정이다. 따라서 본 연구는 당유자 잎의 여러 가지 용매 추출물의 항산화 활성을 살펴보고 암세포의 세포사멸 효과에 대한 가능성을 제시하고자 한다. 당유자 잎 유기용매 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성은 항산화제로 널리 알려져 있는 BHT 및 녹차 추출물과 비교하였을 때, 500 μg/mL의 농도에서는 n-butanol과 ethyl acetate 분획(EF)에서 각각 71.92%와 71.86%로 높은 활성을 나타내었지만 50 μg/mL 농도에서는 EF에서 가장 높은 활성을 나타냈다. t-BHP 처리로 유발된 HepG2 세포의 ROS 수준, 지질 과산화, DNA 손상에 대한 억제 효과는 EF의 낮은 농도에서도 유의하게 나타났다. 또한 MTT assay를 통한 세포 보호 효과에서도 500 μg/mL의 농도에서 약 95%의 우수한 세포 보호효과를 가지는 것을 확인하였다. 또한 HepG2 세포를 EF 처리 후, t-BHP로 apoptosis를 유도한 결과, t-BHP만을 처리한 세포에서는 분획물을 처리하지 않은 대조구에 비해 apoptotic body가 많이 관찰되었으며, p53, cleaved caspase 3, cleaved caspase 7, 및 cleaved PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 비해 EF를 처리한 세포에서는 농도 의존적으로 apoptotic body의 생성을 억제하였으며, apoptosis에 관여하는 여러 단백질들의 발현 또한 억제하였다. 또한 당유자 잎의 ethyl acetate 분획물의 항암 활성을 알아보기 위하여, HepG2 세포에 EF를 72시간 동안 처리하였다. 그 결과 농도의존적으로 세포 성장을 억제하였으며, 정상 세포주에서는 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한 DNA 손상 및 apoptotic body 형성에 있어서도 농도 의존적으로 apoptosis를 일으키는 것으로 나타났다. 마지막으로 apoptosis에 관계된 여러 가지 단백질들의 발현을 western blotting으로 확인하였다. 그 결과 pro-apoptotic 단백질인 Bax와 Bad의 발현은 증가시켰고, 이와는 반대로 anti-apoptotic 단백질인 Bid의 발현은 감소시켰다. 또한 caspase 3 및 PARP의 발현 역시 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 향후 당유자 잎의 생리활성 성분을 이용한 다양한 제품 개발을 통해 당유자의 소비 증진과 소비자의 건강 증진에 기여할 수 있을 것이라 사료된다.

ROS include three major radical species: superoxide anion radicals (O₂.－), hydrogen peroxide (H₂O₂), highly reactive hydroxyl radical (.OH), and peroxyl radicals (ROO.－) (Halliwell et al., 1995). These reactive ROS cause destructive and irreversible damage to the components of a cell, such as lipids, proteins and DNA (Lopaczyski and Zeisel, 2001). Natural antioxidants have a wide range of biochemical activities, including inhibition of ROS generation, direct or indirect scavenging of free radicals, and alteration of intracellular redox potential (Finkel and Holbrook, 2000). Antioxidants have been used to inhibit apoptosis because apoptosis was initially thought to be mediated by oxidative stress (Hockenhery et al., 1993). Many antioxidant materials have anticancer or anticarcinogenic properties (Johnson et al., 1994; Dragsted et al., 1993). Dangyuja (Citrus grandis Osbeck) is distributed solely in Jeju Island in south Korea and the fruit has been utilized for a long time as a traditional herb medicine in Jeju Island. Most Citrus species accumulate abundant quantities of flavonoids during the development (Benavente-Garcia et al., 1993; Castillo et al., 1992, 1993). The present study was therefore designed to investigate whether dangyuja leaf inhibits t-BHP-induced oxidative stress and to characterize the mechanism of its anticancer effects in human hepatoma cell line (HepG2). The EF was confirmed to exhibit antioxidant and anticancer activities. Among the various solvent extracted fractions of dangyuja leaves, the ethyl acetate-extracted fraction (EF) showed the greatest 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity. Also, the generation of reactive oxygen species (ROS) was reduced and the level of lipid peroxidation inhibitory capacity was increased in cells pretreated with EF before t-BHP treatment. Their MTT assay showed that the EF reduced t-BHP-induced cytotoxicity dose-dependently in human hepatoma HepG2 cells. Furthermore, the EF exhibited anti-apoptotic actions on the oxidative damaged HepG2 cells; it inhibited chromosomal DNA degradation and chromatin condensation and reduced the expression of apoptosis-related proteins such as p53, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, and cleaved PARP in a dose dependent manner. These results suggest that EF from dangyuja leaf have both antioxidant properties and protective effect about the t-BHP in HepG2 cells. Furthermore, to confirm the induction of apoptosis by treatment of the EF in HepG2 cells, cells cultured with various concentrations of the EF for 24 h. Treatment of HepG2 cells with various concentrations of EF resulted in growth inhibition in HepG2 cells. However, the EF did not exert any significant cytotoxic effect on normal mammalian cell line CCD25Lu, confirming the cancer-selective cytotoxicity. Also, EF-treated cancer cells were induction of apoptosis in a dose-dependent manner as determined by chromatin condensation and DNA damage in HepG2 cells. Moreover, the EF induced the Bax and Bad protein levels in a time-dependent manner, whereas the Bid, caspase-3 and PARP protein levels were slightly decreased. Our findings showed that EF exhibited potential anticancer activity against hepatocellular carcinoma in vitro through DNA damage effect, chromatin condensation and apoptosis induction of cancer cells. Based on these data, it can be concluded that the EF of dangyuja leaf may be useful as an antioxidant and anticancer agent.