Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Active Compounds Isolated from Ecklonia cava

Abstract

Part I. In the present study, the polyphenolic compounds have been isolated from Ecklonia cava and identified as pyrogallol-6,6'-bieckol (PYB), 6,6'-bieckol (BEK), 2,7''-phloroglucinol-6,6'-bieckol (PHB), and pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol (PPB) by NMR and LC mass spectroscopy. The antioxidant properties of the active compounds were investigated against H₂O₂-induced cell damage. The antioxidant potential of the active compounds were evaluated by several in vitro assays such as scavenging activities (DPPH, hydroxyl, alkyl, superoxide radical scavenging assays) by electron spin resonance (ESR) spectrometry, intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity (DCFH-DA assay), and DNA damage (comet assay). The active compounds (PYB, BEK, PHB, and PPB) showed strong scavenging activities on DPPH, alkyl, hydroxyl, superoxide radical scavenging (IC_(50) ; 0.4, 0.43, 0.5, and 0.88 ug/ml for DPPH, IC_(50) ; 1.76, 1.92, 2.02, and 2.48 ug/ml for alkyl, IC_(50) ; 39.54, 41.75, 73.68, and 61.30 ug/ml for hydroxyl, IC_(50) ; 18.50, 20.27, 55.71, and 166.22 ug/ml for superoxide), respectively. Further, all the active compounds effectively inhibited H₂O₂-induced DNA damage. Hence, these results showed that the active compounds, available in E. cava could be used as natural antioxidant agents in food and pharmaceutical industries. Part II. Ecklonia cava has reported anti-thrombotic, immunomodulatory and antiinflammatory effects in vitro and in vivo. We evaluated the potential activity of the derivates such as the sulfated polysaccharide from E. cava on anti-inflammatory activity in LPS-stimulated RAW 264.7 cell. In this study, E. cava was collected from Jeju Island of Korea and hydrolyzed by food grade and less expensive carbohydrases and proteases. We showed the AMG digest, which is the product hydrolyzed by AMG, has the highest inhibitory effects on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. To identify the active compounds from the AMG digest, we performed the molecular membrane system, the ethanol separation, the anion exchange and gel permeation chromatography, and the 50 kDa over fraction, the crude polysaccharide (CPS) and the purified polysaccharide (PPA) were obtained. The AMG digests' derivates (50 kDa over fraction, CPS and PPA) significantly inhibited the NO production and PPA showed the highest inhibitory activity on NO production. Also, PPA decreased the prostaglandin-E₂ (PGE₂) production and suppressed the inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression in the LPS-stimulated Raw 264.7 cells. Thus, the PPA inhibited NO and PGE₂ production through the inhibition of iNOS and COX-2 expression in LPSstimulated RAW 264.7. These results suggest that the anti-inflammatory activity of PPA may be due to modulation of anti-inflammatory agent.

이 연구는 감태로부터 생리활성 성분을 분리·정제한 후 항산화와 항염증 활성을 측정하여 Part I 과 Part II 로 분리하여 그 내용과 결과를 요약하였다. PART I. 감태 유래 폴리페놀 화합물의 항산화 활성 활성 산소종(ROS, reactive oxygen species)이란 최외각 전자 궤도에 쌍을 이루지 못하는 전자를 가지는 자유 라디칼 (free radical)과 여기에서 파생된 여러 가지 산소화합물의 집합이라 할 수 있다. ROS는 인간을 비롯한 동식물의 체내에 세균과 바이러스 및 곰팡이 등의 이물질이 침입하면 이것들을 공격하여 제거하는 생체 방어 역할을 하고 있다. 그러나 ROS는 반응성이 매우 강하고 불안정하여 세포 구성 성분들인 지질과 단백질 및 당 그리고 DNA 등에 대하여 비선택적이고 비가역적인 파괴작용을 하게 된다. 이러한 결과로 노화 및 암을 비롯하여 뇌질환과 심장 질환 및 동맥 경화 그리고 피부 와 소화기 질환과 염증 또는 자가면역질환과 같은 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 지금까지 알려진 항산화제가 약한 활성과 독성 및 사용상의 한계로 인한 많은 문제점을 내포하기 때문에 천연물에서 항산화제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 일반적으로 천연물의 여러 가지 성분들은 conjugated double bond와 polyphenol 구조 및 SH 기를 갖는 화합물 그리고 alkaloids와 유기산 등이 항산화 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 감태(Ecklonia cava)는 갈조식물 다시마목 (Laminariales) 미역과 (Alariaceae)에 속하며 주로 우리나라 동·남해안과 제주 연안 및 일본에 서식하고 있다. 이들은 전복과 소라의 먹이가 되며 예전에는 주요 알긴산 제조 원료로 사용되었으나 최근에는 풍조 (drifted algae)로 유기 활성 물질 연구 대상종으로 부각되었다. 감태의 밝혀진 주요 생리활성 물질은 phlorotannin 계열과 polysaccharide 계열이 있으며 HIV-1 역전사 효소 저해활성과 Xanthin oxidase 저해활성 및 tryosinase 활성억제효과 그리고 항응고 활성 및 항암 활성 등이 연구 보고된 바 있다. Part 1에서는 감태 생리활성 성분을 80% methanol을 이용하여 추출하여 ethyl acetate을 첨가하여 분획하였고, 이렇게 분획된 ethyl acetate fraction은 celite column chromatography에 충진 후 hexane과 dichloro-methane 및 diethyl ether 그리고 methanol fraction으로 분획하여 fraction 별 항산화 실험을 측정한 결과, diethyl ether fraction에서 가장 높게 항산화 활성을 보였다. Diethyl ether fraction은 Silica column 와 Sephadex LH-20 column chromatography를 통해 정제된 후 RP-HPLC를 이용하여 분석하였고 분리된 4개의 성분을 LC-mass 와 NMR을 통하여 구조 분석 하였다. 구조 분석 결과 4개의 성분에서 3개의 신물질과 이미 알려진 1개의 물질임을 확인 할 수 있었다. 구조가 밝혀진 4개 성분에 대한 항산화 활성은 ESR을 이용하여 라디칼 소거활성이 측정되었고, 정상세포인 Vero cell의 산화적 손상 억제 활성을 측정하였다. 그 결과 4개의 성분들은 모두 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며 Vero cell에 대한 산화적 손상이 억제 되어 우수한 세포 보호효과를 나타냈다. PART II. 감태 유래 다당류의 항염증 활성 염증은 손상에 대한 살아 있는 조직의 반응으로 생체 조직이 물리적이나 기계적으로 또는 화학적이거나 생물학적 자극에 의하여 손상을 받았을 때 이를 국소화 시키고 정상 부위로 되돌리려는 생체 방어기전이다. 이는 생체에 유해한 자극이 가해지고 난 후의 방어기전으로부터 수복 과정까지의 모든 경과를 가리킨다. 이러한 염증 반응은 혈관이 있는 조직에서만 일어날 수 있는 특징을 가지고 있다. 제 1기는 혈관의 확장과 혈관 투과성의 항진, 제2기는 백혈구의 유주와 점착, 그리고 제3기는 육아조직의 형성과 혈관신생을 보여준다. 염증 진행은 염증부위로부터 히스타민과 브라디키닌 및 프로스타들라딘 등의 화학물질이 분비되어 진행된다. 국소증상은 발적이나 종창과 열감이나 동통 및 부종 또는 기증장애 등의 징후가 있다. 면역 반응이나 백혈구 증가 같은 전신증상을 나타내는 경우가 있다. 특히 염증 부위의 활성화된 macrophage는 cytokine과 prostaglandin 및 nitric oxide 등을 생성함으로써 염증 매개 역할을 한다. NO(nitric oxide)는 라디칼을 가진 가스성의 물질이며, 생체 내에서 짧은 시간 동안만 존재한다. NO는 생체 내에서 심혈관계의 항상성 조절과 혈액 응고 및 신경 전달 등에서 중요한 역할을 하지만 독성을 나타내기도 한다. NO의 과잉 생성은 여러징후들(circulatory shock, atherosclerosis, cardiac allograft rejection, chronic inflammation, cardiac infarction, cancer)과 연관 있음이 밝혀지고 있다. NO는 L-arginine에서 촉매제인 nitric oxide synthase (NOS)의 영향으로 L-citrulline으로 바뀌며, 이 때 NO가 생성된다. NOS의 isoform은 크게 3가지이며 (nNOS (neuronal), eNOS (endothelial), iNOS (inducible)) nNOS와 eNOS는 constitutive 하지만 inducible form은 iNOS 뿐이다. iNOS는 LPS와 cytokine의 자극인자에 의해서 macrophage와 같은 염증세포에서 유도되어 constitutive form 보다 1000배나 많은 NO를 생성하게 된다. 이때 생성된 다량의 NO는 염증 반응을 야기하거나 cyclooxygenase (COX) 의 활성을 촉진시키게되어 염증 반응을 심화시킨다. NO 생성 억제는 항염증제 기전을 연구하는데 있어 좋은 치료 target 이라고 할 수 있다. 이 Part 2 에서 수용성 활성 물질 제조는 효소적 추출 방법을 이용하여 건조된 감태로부터 당 분해효소와 단백질 분해효소로 추출하였다. 각 효소 별 추출물에 대한 항염증 측정 결과는 AMG 추출물이 높은 활성과 추출 수율을 가지고 있어 AMG 효소 추출물로 항염증 물질을 분리·정제 하였다. AMG 효소추출물을 50kDa molecular weight membrane으로 분획하였고 50kDa 이상 분획물과 50kDa 이하 분획물의 염증 활성을 측정한 결과는 50kDa 이상 분획물에서 더 높은 활성을 보였으며 50kDa 이상 분획물을 에탄올 침전법을 이용하여 polysaccharide를 침전시켜 분리하였다. 이 두 개의 분획물을 가지고 항염증 실험을 한 결과는 침전된 분획물(Polysaccharide fraction)이 높은 염증 억제 활성을 나타내어 이를 정제 하였다. 침전된 polysaccharide 분획물은 DEAE-cellulose와 Sepharose-4B 컬럼을 이용하여 정제되었고 Bio-LC로 당 성분이 분석 되었다. 이 분석 결과는 Fucose 함량이 82%였으며 Galacatose 함량은 11% 이었다. 또한 황산기 함량을 측정한 결과 정제된 polysaccharide는 0.92%의 황산기를 함유하고 있었으며 이를 통하여 정제된 polysaccharide는 해조 유래 다당류인 sulfated-fucoidan이라 보여진다. Polysaccharide를 이용한 항염증 실험한 결과는 NO와 PGE₂ 생성 및 iNOS 그리고 COX-2 발현을 농도 의존적으로 억제 하였다. 이러한 결과를 종합하면 감태의 생리 활성 성분은 항산화 활성 및 항염증 활성에 효과적임이 입증하였고, 기존의 합성 항산화제 및 항염증제가 가지는 인체 안전성 문제를 해결하는 효시적 연구이다.