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B형 간염 바이러스 유전자의 basal core promoter와 precore부위의 변이가 B형 간염 바이러스의 복제 능력 및 항 바이러스 치료제에 영향

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Alternative Title
Influence of basal core promoter and precore mutations on HBV replication and sensitivity to antiviral agent in genotype A and C
Abstract
연구배경: 만성B형 간염의 치료에 있어서 viral factor인 치료 전 혈청 HBV DNA의 수준과 B형 간염바이러스의 유전자형이 중요한 예측인자로 작용한다. 혈청 HBV DNA level은 바이러스의 복제능력과 연관 있는데 바이러스의 복제능력에 영향을 주는 주요한 인자로는 바이러스 유전자의 basal core promoter (BCP) 와 precore (PC)부위의 변이이며 주로 BCP mutation (A1762T/G1764A) 또는 PC mutation (G1896A) 가 있다. 이러한 변이는 바이러스의 genotype 및 subgenotype에 따라 발생빈도의 차이가 있다. 한국에서의 주요 유전자형인 Genotype C2에서 약 80% 이상의 환자에서 BCP와 PC변이가 발생하는 반면에 서양인의 주요 유전자형인 genotype A2에서는 발생빈도는 20% 미만이다. 따라서 Genotype C가 다른 유전자형에 비해 항 바이러스 치료효과가 낮은데 이는 바이러스의 복제를 증가시키는 BCP 및 PC변이와 연관이 있을 것으로 생각된다. 또한 현재까지 대부분의 in vitro 항 바이러스 치료 효능 실험은 genotype A에서 진행 되여 genotype C를 모델로 한 in vitro 실험이 필요하다고 생간 된다.
연구목적: genotype C2를 이용한 in vitro 실험모델을 만들고 BCP및 PC변이가 바이러스의 증식에 대한 영향 및 항바이러스제에 대한 영향을 연구하고자 한다.
재료 및 방법: B형 간염 환자의 혈청에서 HBV DNA를 추출한 다음 염기서열분석으로 Genotype A2와 C2인 바이러스를 선택한 다음 바이러스의 전체유전자를 PCR방법으로 증폭하였다. 다음 SapI enzyme으로 자르고 gene expression vector 인 pHY106에 연결시켰다. genotype A2와 C2인 바이러스 유전자를 가지고 있는 plasmid DNA를 Huh7 cell에 transfection시켜 바이러스 증식능력을 확인한 다음 증식능력을 우수한 plasmid DNA를 wild type로 지정하였다. 또한 BCP변이, PC변이 및 BCP+PC변이가 바이러스의 증식에 대한 영향을 연구하기 위하여 site-directly mutagenesis 방법으로 BCP, PC 및 BCP+PC변이를 가지는 plasmid DNA를 만들었다. 다음 이들을 Huh7 cell에 transfection하여 바이러스의 증식능력 및 항 바이러스제에 대한 민감성을 southern blot으로 확인하였다.
결과: BCP, PC 그리고 BCP+PC변이들은 B형 간염 바이러스의 genotype에 연관 없이 모두 wild type에 비해 세포 내 바이러스의 복제를 증가시켰다. 바이러스의 세포 밖으로의 분비에 대한 영향을 확인하기 위하여 배양 상층 액에서 바이러스 DNA를 추출한 다음 real time PCR로 바이러스 DNA의 양을 측정하였다. 결과 이러한 변이가 바이러스의 세포 밖으로의 분비에는 큰 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 다음으로 항바이러스제에 대한 변이의 영향을 확인 하기 위하여 현재 임상에서 사용되는 항바이러스 제제인 lamivudine entecarvir 그리고 clevudine를 농도별로 처리하여 각각 50%의 바이러스를 억제하는 IC50값을 구하여 비교하였다. 결과, 이러한 변이들은 대체로 유전자 형에 관계없이 모든 mutant type의 IC50값이 wild type 에 비해 높을 것을 확인 하였다. 특히 중요한 것은 초기 바이러스의 양이 적으면 적을 수록 바이러스 억제 효율이 높아 적은 양의 약물로도 바이러스를 효과적으로 억제할 수 있었다. 반대로 바이러스의 양이 많을 수록 동일한 수준의 바이러스 억제효과를 나타내기 위해서 더 높은 농도의 약물이 필요하다는 것을 확인할 수 있습니다.
결론: 첫째, BCP 및 PC 변이는 유전자형에 관계없이 세포 내 바이러스의 복제능력을 증가 시키지만 바이러스의 분비엔 큰 영향을 미치지 않는다.
둘째, 바이러스의 복제가 증가하면 할 수록 항바이러스제제의 효능이 낮아진다.
따라서 이러한 원인 때문에 BCP/PC mutation 빈번하게 일어나는 genotype C가 다른 유전자형에 비해 항v바이러스 치료효능이 낮을 거라고 생각된다.
Hepatitis B virus (HBV) with genotype A and C has different antiviral response and frequency of basal core promoter (BCP) and precore (PC) mutations. In this study, we investigated the influence of these mutations on hepatitis B virus replication and sensitivity to antiviral agents. Genotype A and C recombinant HBV strains with either BCP mutation, PC mutation or BCP+PC mutation were used to study the viral replicating capacity and sensitivity to antiviral agents (lamivudine, entecarvir, and clevudine) in Huh7 cell line. BCP mutation, PC mutation and BCP+PC mutations increased the viral replicating capacity regardless of genotypes. Furthermore, these mutations increased the antiviral resistances to lamivudine, entecarvir and clevudine. In conclusion, BCP and PC mutations increased viral replication regardless of HBV genotypes in vitro. In addition, patients with theses mutations might need more amount of antiviral agents. In the future, clinical trials are needed to compare the effectiveness of antiviral agents using current standard dose and higher dose in patients with these mutations.
Author(s)
최수길
Issued Date
2009
Awarded Date
2009. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000004623
Alternative Author(s)
Cui, XiuJi
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 의학과
Advisor
송병철
Table Of Contents
1. INTRODUCTION 1
2. MATERIALS AND METHODS 10
1.Construction of plasmid DNA containing HBV DNA -genotype A2 or C2 10
2.PCR based Site-directly mutagenesis 10
3.Cell culture and transfection 13
4.Isolation of intracellular HBV core particle and southern blot analysis 14
5.Isolation of extracellular HBV and quantitative real-time PCR analysis 15
3. RESULTS 17
1. Replication competency of clinical isolates 17
2. Influence of BCP mutations and PC mutations on intracellular viral replication 17
3. Influence of BCP and PC mutations on extracellular HBV DNA level 18
4. Sensitivity to antiviral agents 18
4. DISCUSSION 32
5 REFERENCES 36
6. ABSTRACT IN KOREAN 46
ACKNOWLEGEMENT 48
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
최수길. (2009). B형 간염 바이러스 유전자의 basal core promoter와 precore부위의 변이가 B형 간염 바이러스의 복제 능력 및 항 바이러스 치료제에 영향
Appears in Collections:
General Graduate School > Veterinary Medicine
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