CHARACTERIZATION OF INTERFERON STIMULATED GENES (ISGs) FROM DISK ABALONE (Haliotis discus discus)

Abstract

척추동물의 면역 시스템은 인터페론 시스템에 의해 바이러스의 억제 작용을 가진다. 인터페론은 생물학적 기능의 넓은 범위로 봤을 때 cytokines에 속하는 멀티 유전자 그룹이며. 바이러스에 대하여 인터페론 자극 유전자들의 전사 조절을 통하여 항바이러스 응답 그리고 세포증식, 면역조절과 염증 유발 반응에도 관여한다. 이들 인터페론 자극 유전자들은 Mx와 같은 인터페론 type I (α/β)과 GILT 같은 type II (γ)로 분류할 수 있다. Mx 단백질은 잘 연구되어진 type I 인터페론 유도 항바이러스 단백질인 반면 GILT는 한정된 항원에 대해 이황화 결합을 감소시킴으로써 major histocompatibility complex (MHC) class II의 변화와 인식에 관여하는 핵심 효소로 기술되어졌고, 이와 같이 결합이 풀린 천연 단백질인 항원은 proteases에 의해 분해되어지게 된다. 이 연구에서는 전복 normalized cDNA library로부터 Mx와 GILT 유전자를 분리하고 AbMx 와 AbGILT의 전체 유전자 서열을 확인하였으며 그 단백질들을 코딩하는 유전자들을 NCBI database에서 알려져 있는 다른 유전자 서열들과 비교하여 분석하였다. 그리고 이미 밝혀진 다른 관계된 유전자들과의 관계를 밝히기 위해 ClustalW pairwise, multiple analysis와 phylogenetic analysis를 가지고 AbMx와 AbGILT 유전자의 특성을 분석하였다. In vivo에서 전복의 Mx 단백질 발현 분석을 위해 poly I:C 100 ㎕ (10 μg/㎕)를 전복의 근육내로 주입하고, 그 조직 특이적 mRNA 조절을 확인하기 위해서 주입 후 24시간, 48시간째에 각각의 조직(아가미, 외피, 발과 소화관)으로부터 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 발현률을 측정하였다. 전복의 GILT 단백질 발현 분석은 GILT의 유도를 위해 그람음성세균인 Vibrio alginolyticus를 전복의 근육내로 150㎕ (OD_(600)=1) 주입하여 수행되어졌다. 그리고 poly I:C와 PHA에 의한 GILT 유도를 확인하기 위해, 각각의 전복 그룹별로 poly I:C 100㎕ (10 μg/㎕)와 PHA 100 ㎕ (20 μg/㎕)를 근육내로 주사하였고 아무것도 처리되지 않은 그룹을 control로 사용하였다. 조직 특이적 mRNA 발현의 유도를 확인하기 위해서 전복내로 처음 주입 후 12, 24, 48시간째에 각각 아가미, 외피, 소화관에서 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 발현률을 측정하였다. 전복의 Mx cDNA의 유전자 서열은 1533 bp (511 amino acids)의 open reading frame을 포함하는 1664 bp로 확인되어졌다. 전복 Mx 유전자를 분석한 결과 tripartite guanosine-5´-triphosphate (GTP)-binding motif와 dynamin family signature를 포함하고 있었다. 부가적으로, C-terminal 영역에 L_(468), L_(475), L_(489), L_(510) 루이신 잔기들이 확인되었고 다른 leucine zipper motif 들처럼 기질에 결합할 수 있도록 해 준다. 전복의 Mx 단백질은 얼룩메기 Mx1, 무지개 송어 Mx2, 대서양 넙치 Mx와 44% 아미노산 서열이 유사성을 나타냈다. poly I:C를 전복 내로 주입한 후 24시간과 48시간째에 아가미와 소화관 조직에서 RT-PCR 발현 분석을 한 결과, Mx의 발현율이 증가했음을 확인하였다. Mx mRNA는 건강한 전복에서 아가미, 소화관, 외피와 발 조직에서 조직 특이적으로 발현되어졌다. 계통학적 분석에 의해 전복의 Mx 단백질은 다른 Mx 단백질들과 계통상 거리가 먼 것으로 확인되었다. 하지만, 전복의 Mx는 tripartite GTP-binding, dynamin family signature motifs와 poly I:C 주입에 위한 Mx mRNA 발현률 상승과 관련하여 어류나 포유동물의 Mx 단백질들과 높은 유사성을 나타내었고 이는 공통적인 조상에서 나누어졌음을 시사한다. AbGILT의 전체 유전자는 684 bp (228 amino acids)의 open reading frame을 포함하여 전체 807 bp가 확인되었고 진단된 분자량과 isoelectric point는 각각 25 kDa과 7.8을 나타내었다. AbGILT의 N-말단에는 신호서열을 포함하고 있었으며 19-20 아미노산 잔기 사이에서 절단되는 것으로 확인되었다. AbGILT는 두 개의 Cys-XX-Cys active site motifs (^((23)CLDC^(26), ^(46)CPYC^(49))를 포함하였고 이 motif는 포유동물에서도 밝혀진바 있다. AbGILT에서 GILT 신호서열(^(92)CQHGX₂ECX₂NX₄C^(107)) 또한 확인되었고 이것 역시 대부분의 GILT 단백질들의 공통적인 motif이다. 전복의 GILT는 Branchiostoma belcheri tsingtaunse GILT와 38%로 가장 높은 유사성을 나타내었고 지브라피쉬, 복어, 큰노랑동갈민어, 인간의 GILT와 각각 36%, 35%, 33%, 24% 유사성을 나타내었다. RT-PCR 발현 분석을 통해 PHA를 전복 내로 주입한 후 24시간 후에 아가미, 외피와 소화관에서 GILT의 발현율이 증가함을 확인하였고 V. alginolyticus를 주입한 후 48 시간째에 아가미와 소화관에서 GILT의 발현율이 증가함을 확인하였다. 이와는 대조적으로 poly I:C에 대해서는 48시간동안 GILT 발현이 유도되지 않았다. 하지만, 전복의 GILT는 아가미, 외피와 소화관 조직에서 특별한 자극이 없이도 초기 면역 방어를 위해 발현되어진다. 결론적으로, 본 연구에서는 까막전복으로부터 인터페론 자극 단백질인 Mx와 GILT의 유전자를 분리하여 그 염기서열 특성을 분석하고 조직 발현 분석들을 수행하였고 이 연구들은 무척추동물의 인터페론 조절 면역 시스템에 대한 면역학적 연구에 새로운 토대가 될 것이다.

The vertebrate immune system has an effective antiviral response mechanism mediated by interferon (IFN) system. IFNs are multi gene family soluble cytokines with wide range of biological action. IFNs are involved in regulation of antiviral response, cell proliferation and differentiation, modulation of immune and inflammatory responses through transcription regulation of IFN-inducible genes (ISGs) coding for various proteins. Those ISGs could be classified based on the inducible type of IFN such as Mx by type I IFN (IFN-α/β) and GILT by type II IFN (IFN-γ) which are two important genes focus on this study in disk abalone (Haliotis discus discus). Mx is one of the well-known type I IFN-induced antiviral proteins. In the other hand GILT has been described as a key enzyme in the processing and presentation of major histocompatibility complex (MHC) class II restricted antigen (Ag) by catalyzing disulfide bond (S-S) reduction, thus unfolding native protein Ag and facilitating subsequent cleavage by proteases. In this study, both Mx and GILT isolated from a whole abalone normalized cDNA library and cDNAs were sequenced to determine the full length sequences of AbMx and AbGILT. The resulting full-length AbMx and AbGILT sequences were compared with other known sequences available in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. After having the full length of AbMx and AbGILT, sequence characterization, ClustalW pairwise and multiple analysis, and phylogenetic analysis were performed in order to establish the relationship between known respective genes. For the in vivo AbMx expression analysis, abalones were intramuscularly (i.m.) injected with 100 μl (10 μg/μl) of poly I:C in phosphate-buffered saline (PBS) and tissue specific mRNA up-regulation was measured in gill, mantle, foot and digestive tract by RT-PCR after 24 h and 48 h post injection. For the in vivo AbGILT expression analysis, abalones were i.m. injected with 150 μl of V. alginolyticus Gram negative bacteria in PBS obtained from Korean collection for type cultures (KCTC: 2472) to induce abalone GILT. For the GILT induction by poly I:C and PHA, abalones from each group were intramuscularly injected with 100 μl (10 μg/μl) of poly I:C (Sigma, USA) and 100 μl (20 μg/μl) of PHA (Sigma, USA) in PBS. None treated three abalones were kept as a control group separately. The tissue specific mRNA up-regulation was measured in gill, mantle, and digestive tract samples by RT-PCR after 12 h, 24 h and 48 h post injection. The full-length 1664 bp of abalone Mx cDNA contained a 1533-bp open reading frame that codes for 511 amino acids. Within the coding sequence of abalone Mx, characteristic features were found, such as a tripartite guanosine-5´-triphosphate (GTP)-binding motif and a dynamin family signature. In addition, leucine residues in the C-terminal region displayed a special leucine domain at L_(468), L_(475), L_(489) and L_(510), suggesting that abalone Mx may have a similar oligomerization function as other leucine zipper motifs. Abalone Mx protein exhibited 44% amino acid similarity percentage with channel catfish Mx1, rainbow trout Mx2 and Atlantic halibut Mx. RT-PCR expression analysis showed that enhanced Mx expression in abalone gill and digestive tissues 24h as well as 48 h after injection of poly I:C. Mx mRNA was expressed in gill, digestive gland, mantle and foot tissues in healthy abalone, suggesting that the basal level of Mx expressed is tissue-specific. There is no known Mx protein closely related to abalone Mx according to phylogenetic analysis. Abalone Mx may have diverged from a common gene ancestor of fish and mammalian Mx proteins, since abalone Mx showed high similarity in terms of conserved tripartite GTP-binding, dynamin family signature motifs and poly I:C enhancement of Mx mRNA expression. The 807-bp full length AbGILT gene consists of an open reading frame of 684-bp, encoding 228 amino acid residues. The predicted AbGILT protein has a molecular weight of 25 kDa and an isoelectric point of 7.8. The N-terminus of the AbGILT was found to have a signal peptide, representing a cleavage site amino acid position at 19-20. AbGILT contains two Cys-XX-Cys active site motifs, located at amino acid positions ^(23)CLDC^(26), ^(46)CPYC^(49), which motif is found in mammalian GILT proteins in conserved manner. AbGILT exhibited a GILT signature sequence ^(92)CQHGX₂ECX₂NX₄C^(107), which is also a motif common to most of GILT proteins. Abalone GILT exhibited the highest level of similarity percentage (38%) with Branchiostoma belcheri tsingtaunse GILT while it shares 36%, 35%, 33% and 24% similarity percentage to zebrafish , pufferfish, large yellow croaker and human GILT respectively. RT-PCR expression analysis results showed that AbGILT was up-regulated in gill, mantle and digestive tract after 24 h post injection of PHA while V. alginolyticus up regulation showed in gill and digestive after 48 h. In contrast, AbGILT expression was not up regulated by poly I:C induction during the 48 h induction time. However, Abalone GILT was constitutively expressed in gill, mantle, and digestive tract tissues suggesting that abalone GILT is supporting to maintain first line of immune defense at basal level even without stimulation in disk abalone. Taken together, isolation, sequence characterization and tissue expression analysis of IFN inducible Mx and GILT genes in disk abalone could be considered as new era of immunological research with respect to invertebrate IFN regulatory immune system.