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Development of a Rosette Gall in Aster scaber Thunberg

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Abstract
The plant galls occurring in Aster scaber Thunberg had unique morphological characteristics. Their apparent shape at mature stage resembled a miniature plant which showed a well-organized rosette-like morphology (rosette gall), although they showed extreme dwarfism. Furthermore, the rosette gall formed a flower-like organ at the later stage of development. The rosette gall of A. scaber was reported long time ago by Shinji in 1944, however there are no subsequent studies on it until now except only a few entomological survey. In this study, the rosette gall of A. scaber was investigated in relation with botanical characteristics (Part I), inducer organism (Part II), developmental process (Part III) and genes involved in its development (Part IV) to understand the overall process and regulatory factors in the plant gall development.
The basic structure of mature rosette gall of A. scaber consisted of hemispherical gall basement, ectopic leaves and flower-like organ(s). The sizes of normal mature rosette galls were 0.3 - 2.0cm in diameter and 0.3 - 1.0 cm in height, respectively. Typical rosette galls of A. scaber showed dwarfism and did not develope petiole, internodal stem, inflorescence or root. However, some of the rosette galls developed leaf petioles. Even though rarely, the rosette gall formed floral stalk and developed de novo roots. The rosette gall was developed from any organ of the mother plant including leaf (adaxial and/or abaxial surface), petiole, stem, node, shoot apex and even root. In case of the leaf, the rosette galls were usually developed from the non-meristemic cells between leaf veins unlike ordinary plant organs which differentiated mostly from the meristemic cells near the veins. Together with the non-organ specificity of rosette gall formation, the non-merstemic developments of rosette galls showed direct evidence for the intrinsic totipotency of the plant cells regardless of their origin and degree of differentiation.
The inducer organism of rosette gall in A. scaber was identified as an insect, Dasineura asteriae Shinji (Diptera Cecidomyiidae). In Jeju, Korea the adult insects mated and layed eggs from April to May when the radical leaves of A. scaber emerged from the soil surface. The female layed eggs on the surface of young leaves of the host plant. The egg hatched in 2-4 days, and the larva moved around and settled down at a certain position on the surface of plant organs where the rosette gall was later developed. Thereafter the larva made a chamber within the gall tissue of the rosette gall and resided in the chamber. The larval chamber became surrounded by ectopic leaflets with growth of the rosette gall, and later the chamber developed an additional organ resembling floral bud inside of the rosette gall leaflets. Two or more larvae were often observed in a single rosette gall, and in this case each larva occupied a floral bud. The larva stayed within the rosette gall throughout its larval stages. When the rosette gall aged to senescence in the late of autumn, the larva came out of the rosette gall and entered into the underground soil. The larva developed to a pupa and hibernated during winter time in the soil until next spring.
The developmental process of rosette gall in A. scaber was devided into four phases. The rosette gall initiated with forming a tiny gall tissue on the surface of any organ in the mother plant. In the second phase, the ectopic leaves were differentiated from the gall tissue. In the third phase, the ectopic leaves grew and were organized into a rosette shape miniature plant. At last a floral organ was developed from the center of the rosette gall. The overall process of rosette gall development showed close similarity with the plant regeneration via somatic embryogenesis in the laboratory tissue culture which consisted of dedifferentiation and redifferentiation of plant cells. The development of rosette galls seemed to be regulated by the larva of D. asteriae. At the beginning of the rosette gall development, the initial gall was formed from the point of plant surface where insect larva settled down, not from the point of oviposition. Therefore the gall formation was appeared to be initiated by the insect larva, neither by egg nor adult female. The larva stayed inside the rosette gall throughout the development of ectopic leaves and floral organs. This indicated that the larva controlled all the processes of the rosette gall development including dedifferentiation of differentiated mother plant cells, redifferentiation of gall cells to ectopic leaves, growth and organization of ectopic leaves, and development of ectopic flowers. The dwarfism of the rosette galls also seemed to be related with the larval residence.
For the understanding of rosette gall development at the gene level, the cDNA libray of the host plant, A. scaber and phytohormonal genes of rosette gall were analyzed. The clones of 2306 cDNA from the host plant were clustered into 1843 unigenes which consisted of 45% of known function, 13% of unknown function and 42% of no hit genes, respectively. The library contained 28 genes which putatively related with phytohormone metabolism. Of these three hormonal genes of NIT, IPT and GA3ox encoding key step enzymes in the synthesis of auxin, cytokinin and gibberellin, respectively, were cloned and their expressions were examined. NIT was highly expressed in the ectopic leaves of the rosette gall while its expression in the gall part was similar to mother leaf. In case of IPT, it was highly expressed not only in the ectopic leaves but also in the gall tissue by the similar level. The high expression of IPT over the whole rosette gall was very surprising because cytokinin is known to be synthesized in roots in plants. The high expressions of NIT and IPT suggested that the compact morphology of rosette gall might be related with the levels of auxin and cytokinin. In contrast to NIT and IPT, GA3ox was suppressed in the ectopic leaf of rosette gall while its expression in the gall part were similar to mother leaf. Thus the dwarfism of the rosette gall seemed to be resulted from the lack of gibberellin due to the suppression of GA3ox in the inner leaf because gibberellin 3beta-hydroxylase encoded by this gene mediates the final step in the synthesis of active gibberellin. Interestingly, the expression of an unknown gene denoted as GAS was high in the ectopic leaf of rosette gall and low in the gall part which showed inversed relationship with the expression of GA3ox. The length of this gene was relatively short, 450bp (150 amino acid), and had no introns which supposed to play as a regulatory element. The coincident suppression of GA3ox with the expression of GAS suggested that this gene might control the dwarfism of rosette gall, probably via inhibition of GA synthesis.
참취에 발생하는 충영들은 독특한 형태적 특성을 나타내었다. 이러한 충영들은 mautre stage에 비록 왜성인 형태를 갖추었지만, 장미꽃 모양의 기관 (rosette gall) 으로 발달한 완전한 소형식물체의 모습을 하고 있었다. 더군다나, last stage에는 rosette gall은 꽃모양의 기관으로 발달하였다. 참취 식물체에 로제트 모양의 충영이 형성된다는 것은 1944년 Shiji에 의해 보고가 되었으나, 단지 곤충학적 조사를 제외하고는 다음과 같은 연구는 수반되지는 않았다. 충영의 발생에 있어서 전분화과정과 그 조절인자들을 이해하기 위하여 본 연구에서는 참취에 발생하는 rosette gall의 식물학적 특성 (Part I), rosette gall을 형성하는 인자 (Part Ⅱ), rosette gall 분화과정 (Part Ⅲ)과 rosette gall 발생에 포함되는 유전자들 (Part Ⅳ)을 조사하였다.
Mature stage의 참취 식물체의 rosette gall의 기본적 구조는 반구형의 혹모양과 ectopic 소엽이 발생하였고 꽃모양의 기관으로 구성되었다. rosette gall 들은 폭이 0.3 - 2.0 cm 이고, 높이는 0.3 - 1.0 cm 로 다양한 크기를 나타냈다. 대표적인 참취 식물체의 rosette gall 들은 왜성의 작은 식물체이나 엽병, 절간 줄기, 화서 또는 뿌리는 발생하지 않았다. 그러나 소수의 rosette gall 들은 잎 엽병들이 발생하는 것이 관찰되었다. 또한 좀처럼 보기드문 현상이지만, rosette gall은 화경과 de novo 패턴의 뿌리 발생이 관찰되었다. rosette gall 은 모식물체의 모든 부분, 즉 잎의 앞면과 뒷면, 엽병, 줄기, 절, 정단부위 및 뿌리에서도 발생하는 것이 관찰되었다. 보통의 식물 기관들은 잎맥 부근의 분열조직세포로부터 분화하지만, 잎에서 발생한 rosette gall 인 경우에는 잎의 잎맥 사이의 비분열조직세포로부터 항시 발생하는 것을 관찰할 수 있었다. 비기관 특이적인 rosette gall 형성뿐만 아니라 비분열조직에서의 rosette gall 형성은 비록 rosette gall 분화 원인과 분화정도에 관계없이 식물세포의 고유한 전분화능력에 대한 직접적인 증거를 보여주는 예라고 할 수 있다.
참취 식물체에 발생하는 rosette gall을 유도하는 원인 곤충은 파리목 혹파리과의 나도쑥혹파리 (Dasineura asteriae Shinji) 로 동정 되었다. 4월부터 5월 사이에 성충들은 교미를 하였으며, 토양으로부터 출아한 참취 식물체의 근생잎 표면에 산란을 하는 것이 관찰이 되었다. 암컷 성충들은 참취 식물체의 어린잎에 산란을 하였으며, 그 알들은 2-4 일 후 부화하였다. 부화된 유충들은 정착할 곳을 찾아 움직였으며, 유충들이 정착한 참취 식물체 기관의 표면은 차후 rosette gall로 발생하였다. 유충들은 rosette gall의 gall조직내에 유충방(larval chamber)을 만들었으며, 그곳에서 생존하였다. rosette gall의 성장과 함께 이 유충방들은 ectopic 소엽들로 둘러싸여 졌으며, 이후 ectopic 소엽들이 발생한 rosette gall 내부의 유충방들은 floral bud 로 발달하였다. 하나의 rosette gall 내부에는 2개 이상의 유충들이 각각의 유충방에 서식하는 것이 관찰이 되었으며, 각 각의 유충들은 floral bud 로 둘러싸여 졌다. 유충들은 rosette gall에 서식하며 유충시기를 보냈으며, 늦가을이 되면 유충들은 노화된 rosette gall 에서 나와 토양으로 내려갔다. 유충은 토양에서 번데기가 되고 월동하였으며, 이듬해 봄 성충으로 우화하였다.
참취 식물체에 발생한 rosette gall은 4단계의 발달과정을 거쳤다. Rosette gall 발생초기는 모식물체의 어떤한 기관 표면에서라도 작은 gall 조직들이 발생하였다. 둘째단계에서는 gall 조직으로부터 ectopic 소엽들이 분화하였으며, 셋째단계에서는 ectopic 잎들은 성장하였으며, rosette 모양의 작은 소형식물체로 발달하였다. 그리고 이 소형식물체는 꽃기관으로 분화하는 마직만 단계를 가졌다. Rosette gall의 전분화과정은 식물세포의 탈분화와 재분화를 형성하는 식물조직배양계에서의 체세포 배분화 단계를 거쳐 식물 재분화 단계로 이루어지는 발달과정과 유사하였다. rosette gall 분화는 D. asteriae 유충의 조절에 의해 발생하는 것으로 나타났다. 초기 rosette gall 발생은 곤충의 유충이 정착한 참취 식물체의 조직 표면에서 gall 분화가 시작이 되었으며, 성충이 산란한곳에서는 gall 분화가 발생하지는 않았다. 따라서 참취 식물조직상에 초기 gall 형성은 곤충의 유충에 의해서 나타나는 것이었으며, 성충이나 그 알들에 의해서 gall 들이 형성되는 것은 아니었다. Rosette gall의 ectopic 잎과 꽃기관이 발생하는 기간 동안 유충들은 gall 조직내에서 서식하였으며, 이것은 분화된 모식물세포로의 탈분화 과정과 탈분화된 gall 조직이 ectopic 소엽으로 발생하는 재분화 과정, ectopic 잎의 정형화 및 성장 그리고 ectopic 꽃기관의 발생을 포함하는 rosette gall의 모든 분화 과정을 곤충의 유충이 조절 한다는 것을 시사한다고 할 수 있다. 왜성의 rosette gall들은 또한 유충들의 거주지라 할 수 있다.
유전자 수준에서 rosette gall의 발생을 이해하기 위하여 기주식물인 참취의 cDNA library 와 rosette gall의 식물호르몬 유전자들을 분석하였다. 총 2306개의 cDNA 들을 참취 식물체로부터 얻었으며, 1843개의 unigene 들을 분석한 결과 잠재적 기능이 알려진 유전자는 45% 였으며, 기능을 알 수 없는 유전자는 13%, 그리고 no hit 유전자는 42% 이었다. 그 중 잠재적 기능이 알려진 유전자 중 식물호르몬 대사체계에 관여하는 유전자는 28개가 있었다. 식물호르몬인 옥신, 시토키닌, 지베렐린의 생합성 단계에 관여하는 유전자인 NIT, IPT, GA3ox 를 선발하여 발현 분석을 수행하였다. NIT는 rosette gall의 ectopic 소엽 조직에서 발현이 높았으며, gall 부분의 조직은 모식물체의 잎조직과 발현 양상은 유사하였다. IPT는 모식물체의 잎 조직에 비하여 rosette gall에서 과발현하는 양상을 나타냈다. 그러나 ectopic 소엽 조직과 gall 부분의 조직 간에는 발현 양상은 유사하였다. 시토키닌은 식물의 뿌리에서 합성되는데, rosette gall에서 IPT 의 높은 발현양상은 놀라운 결과라고 추정이 되어진다. NIT와 IPT의 과발현 양상은 옥신과 시토키닌의 합성량을 조절함으로써 rosette gall의 형태를 결정하는 것으로 추정이 된다. NIT와 IPT의 발현 양상과는 대조적으로 GA3ox는 rosette gall의 ectopic 소엽조직에서는 발현 양상이 낮았으나, gall 부분의 조직은 모식물체의 잎조직과 발현양상이 유사하였다. 따라서 왜성 rosette gall의 내부 소엽 조직에서의 GA3ox의 낮은 발현양상은 지베렐린 생합성 단계에 참하는 효소를 암호화하는 지베렐린 3β 수산화 효소의 감소에 의한 결과라고 추정이 된다. 잠재적 기능을 알 수 없는 유전자인 REA28은 흥미롭게도 GA3ox의 발현 양상과는 대조를 이루었다. RAE 28은 rosette gall의 내부 소엽 조직에서 발현이 매우 높았으며, gall 부분 조직에서는 발현이 현저히 낮았다. REA28은 450 bp의 ORF를 갖고 있었으며, 150 amino acid 로 번역되었다. 또한 intron 영역이 존재하지 않았으며, 그리고 regulatory element 로 작용할 것으로 추정이 되었다. Rosette gall 조직에서의 REA 28의 과발현 양상은 GA3ox 의 발현 억제를 수반함으로써 이는 아마도 지베렐린의 합성을 저해함과 동시에 왜성의 rosette gall 발달을 조절한다고 추정이 된다.
Author(s)
이도승
Issued Date
2009
Awarded Date
2009. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000004690
Alternative Author(s)
Lee, Doseung
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 농화학과
Advisor
Riu, Key Zung
Table Of Contents
SUMMARY = 1
PART Ⅰ. Botanical Characteristics of the Rosette = Gall
Abstract = 4
Introduction = 5
Materials and Methods = 7
Collecting plants of A. scaber and rosette galls = 7
Propagation and observation of rosette galls = 7
Results = 9
Structures of rosette galls in A. scaber = 9
Locations of rosette galls within a mother plant = 11
Discussion = 13
Morphological characteristics of the rosette gall in A. scaber = 15
Botanical significance of the rosette gall = 16
PART Ⅱ. The Insect Inducing the Rosette = Gall
Abstract = 17
Introduction = 18
Materials and Methods = 19
Insect collection = 19
Insect identification = 19
Mass rearing insect = 19
Microscopy analysis = 20
Results = 21
Morphology of insect in each development stage = 21
Identification of the insect inducing the rosette gall of A. scaber = 21
Life of insect in the rosette gall = 23
Discussion = 26
The gall midge inducing the rosette gall in A. scaber = 26
Development of the insect with rosette gall development = 26
Summary of D. asteriae life cycle = 27
PART Ⅲ. Process of the Rosette Gall = Development
Abstract = 28
Introduction = 30
Materials and Methods = 32
Process analysis of rosette gall development = 32
Insect-plant interaction analysis = 32
Histological analysis = 33
Scanning electron microscopy = 33
Results = 34
Gall initiation (dedifferentiation) = 34
Leaflet development (redifferentiation) = 36
Organization into rosette shape = 39
Flower-like organ formation = 41
Effect of the insect in the rosette gall development = 42
Discussion = 44
Overall process of rosette gall development = 44
Regulation of rosette gall development by the insect = 47
Significance of the rosette gall in plant development = 48
PART Ⅳ. Genes Over-expressed in Rosette = Gall
Abstract = 49
Introduction = 51
Materials and Methods = 53
Construction of cDNA library of A. scaber = 53
EST sequencing = 53
Construction of subtractive library = 54
Differential display RT-PCR = 55
First strand cDNA synthesis and degenerate RT-PCR = 57
Rapid amplification of cDNA ends, Cloning and sequence analysis = 58
Northern blot analysis = 58
Semi-quantitative RT-PCR = 59
Results = 62
Construction and analysis of cDNA library of A. scaber = 62
Cloning and expression of phytohormone genes = 65
Cloning and expression of differential expression genes in rosette gall Subtractive hybridzation = 69
Cloning and expression of an unknown gene in rosette REA28 = 75
Discussion = 78
Profile of gene expression in the host plant of A. scaber = 78
Phytohormone genes in the rosette gall = 78
Differential expression genes in the rosette gall = 82
A novel gene expressed in the rosette gall = 83
REFERENCES = 84
APPENDIX = 94
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
이도승. (2009). Development of a Rosette Gall in Aster scaber Thunberg
Appears in Collections:
Graduate School of Industry > Environmental Biotechnology
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