Development of Immunological Probe to Assess Reproductive Effort of Black Lip Pearl Oyster (Pinctada margaritifera, Linnaeus 1758) in Chuuk State, Federated State of Micronesia

Abstract

이 연구는 Micronesia 의 Chuuk Lagoon 에 서식하는 흑진주조개의 번식량 측정을 위해 흑진주조개 난 단백질에 특이적인 다클론 항체를 개발하고, 개발된 항체를 이용하여 흑진주조개의 난 단백질의 특성 분석을 수행하였다. 성숙한 흑진주조개 암컷 개체로부터 순수한 알을 분리하고 생화학적인 조성분 분석을 한 결과 총 탄수화물, 단백질, 지방, 무기질의 양은 5.8%, 45.5%, 21.5%, 11.5%로 각각나타났다. 흑진주조개 난 단백질을 항원으로 하여 총 9 주간 토끼면역을 실시하여 항혈청을 분리하였다. 항혈청에 존재하는 난 단백질 외 기타 조직과의 교차반응을 제거하고 수집한 흑진주조개 난 단백질 특이적인 항체의 민감도는 0.07-20 μg/ml 의 난 단백질을 검출 할 수 있는 것으로 indirect-ELISA 결과 나타났다. 제작된 항체가 인지하는 흑진주조개의 난 단백질은 270, 150, 100, 47, 44, 23 kDa 의 분자량의 6 개 단백질인 것으로 확인되었다. 해산 이매패류 종간 알 단백질의 분자적 특성 차이를 확인하기 위하여, 흑진주조개를 포함한 6 종의 해산 이매패류의 난 단백질들을 native 와 denaturing PAGE 를 수행하였고, 제작된 항체를 이용하여 western blotting 분석 및 indirect-ELISA 를 수행하였다. Native 조건 하에서 5 종의 해산 이매패류의 난 단백질은 약 420 kDa 의 단백질이 공통적으로 확인되었으며, 종에 따라 1 개 또는 2 개의 minor band 가 관찰되었다. 이와 달리 denaturing 조건에서의 난 단백질은 다양한 분자량의 범위를 나타내었다. 흑진주조개 난 단백질 특이적인 항체를 이용한 western blotting 과 indirect-ELISA 의 종간 난 단백질 특성 비교 분석에서는, 제작된 항체가 흑진주조개 난 단백질에만 특이적으로 반응하는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 Chuuk State 와 Tahiti 로부터 채집한 흑진주조개 알에 대한 항원 다양성 유무를 확인하기 위해 western blotting 분석을 한 결과에서도 제작된 다클론 항체는 채집지역과 상관 없이 동일한 6 개의 항원 단백질에 반응하는 것을 관찰 할 수 있었다. 실제 번식량 측정에 있어서 indirect-ELISA 의 표준물질은 흑진주조개 알분말과 수컷 개체 분말을 혼합하여 사용하는 것이 알 분말만 이용하여 사용한 것보다 좋은 결과를 나타낼 것으로 사료되며, 개발된 항체를 2.3-3.5 μg/ml 정도를 사용하여도 번식량 측정에 충분할 것으로 사료된다. 위 결과들을 종합하여 볼 때, 이 연구에서 개발된 흑진주조개 난 단백질 특이적인 항체는 정량적인 번식량 측정을 하는데 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 흑진주조개 난 단백질의 특성에 대한 연구 결과는 흑진주조개의 번식 생리와 난 단백질에 관한 기초 자료로 이용될 것으로 사료된다.

To develop black lip pearl oyster(BLP oyster) egg-specific polyclonal antibody and quantify reproductive effort, black lip pearl oyster, Pinctada margaritifera was collected from Chuuk State, Federated State of Micronesia and P. margaritifera eggs was purified. Biochemical composition of ripe eggs of P. margaritifera was similar to that observed in other marine bivalves. The total proteins (45.5%) and lipids (21.5%) are the main components of eggs while ash (11.5%) and carbohydrate (5.8%) are the low composition. To develop a specific antibody against to P. margaritifera egg protein, the homogenized extracts of BLP oyster eggs were immunized to a New Zealand white rabbit during 8 weeks and antiserum was purified 1 and 2 weeks after last immunization. Cross reactivity of rabbit antiserum to other tissue proteins were removed using an immunoadsorbent and then purified a specific IgG (anti-BLP oyster egg prtein specific IgG) by precipitation methods and dialysis. Western blotting showed that anti-BLP oyster egg protein specific IgG reacted with egg proteins of about 270, 150, 100, 47, 44 and 23 kDa under reducing condition. For indirect Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), anti-BLP oyster egg protein specific IgG detected between 0. 07 - 20 ㎍/ml of BLP oyster egg protein. 6 species of marine bivalves egg proteins including P. margaritifera were characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under native and denaturing condition, western blotting and indirect ELISA. As a result, one major single band around 420 kDa under native PAGE was observed as a common protein in all bivalves while 1 or 2 minor bands also identified. On the other hand, it showed the broad range protein patterns under denaturing condition. Western blotting using 6 species of marine bivalves egg proteins showed that anti-BLP oyster egg protein specific IgG only detected in black lip pearl oyster egg protein. In addition, we investigated the specificity of anti-BLP oyster egg protein specific IgG against two isolate of black lip pearl oysters collected from Chuuk State and Tahiti. There is no difference between the geographical variations in egg protein of oysters. Indirect-ELISA was optimized to measure reproductive effort using purified anti-BLP oyster egg protein specific IgG. From the result, using egg protein mixed with somatic tissue protein for standard preparation was the most reliable method then using only egg protein to measure reproductive effort. The result suggested that 1000 times dilution sample extract as antigen with 3 ㎍/ml of anti-BLP oyster egg IgG was optimum condition of indirect-ELISA. In conclusion, a specific IgG against black lip pearl oyster egg protein was successfully developed and will therefore be used in the specific and sensitive quantification of the reproductive effort in the Black lip pearl oyster. And also this results could be supplied the basic information about reproductive biology in bivalves.