DMRT in Protogynous Wrasse, Halichoeres tenuispinis

Abstract

The physiological, behavioral, and functional sex of fish may be determined or induced, and is under the control of various genetic, social, and environmental factors. Fishes exhibit diverse reproductive strategies, including gonochorism, sequential hermaphroditism (protogynous and protoandrous), or synchronous hermaphroditism, with some self-fertilizing species. Despite this diversity, the genes than control sex determination and differentiation are conserved in many animal species. During development, steroid-producing cells convert pregnenolone to testosterone, which functions in sex-hormone synthesis and eventually results in functionally mature sexes. Androgens and estrogens are also conserved as hormonal regulators. Other examples of conserved genes include those encoding 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 11β-hydroxylase, Dax, Hox, Wnt, SF, and aromatases. Sex determination in fish is regulated by DMY, a homolog of the mammalian sex-determining gene SRY. DMY is also located on the Y chromosome and is a duplicate copy of the DMRT gene, which contains a conserved DM domain region and male-specific motif found in Drosophila melanogaster doublesex (dsx) and Caenorhabditis elegans mab3. These male-specific DM domain-containing genes encode novel zinc-finger transcription factors and play key roles in sex development and/or determination. This study was performed to gain insight into sexual differentiation in the protogynous wrasse Halichoeres tenuispinis. First, a full-length cDNA from the wrasse testis (DMRT) and partial cDNA from the ovary (DMO) were isolated by cDNA library screening or rapid amplification of cDNA ends (RACE). Wrasse DMRT was 3,119 bp long and contained the DM domain and the male-specific motif, but not the DMA or DMB domain. It was highly homologous to DMRT cDNAs isolated in other species. Two cDNAs were identified for DMRT: a short sequence and a second, longer sequence with a relatively long 5'-untranslated region (UTR) and additional nucleotide insertions. The DMO cDNA was 545 bp long; the first exon showed 100% nucleotide sequence homology to wrasse DMRT cDNA, but the 5'-UTR was split into two pieces showing near identity to the DMRT genomic sequence. The deduced amino acid sequence of wrasse DMRT included a zinc finger DNA-binding motif and confirmed that the DM domain is highly conserved within phyla. The predicted tertiary structure of the wrasse DM domain showed strong similarity to DM domains in D. melanogaster dsx and human DMRT. Northern blot analysis identified a 3.2-kb transcript roughly equivalent in size to the DMRT nucleotide sequence detected in the testis, but not in the ovary, confirming that this sequence is male-specific in protogynous wrasse. Southern blot analysis suggested that the wrasse genome contains two copies of the DMRT gene. To analyze DMRT structure, contigs were generated from wrasse genomic DNA and re-arranged according to the DMRT cDNA sequence. The open reading frame (ORF) consisted of five exons and four introns. The first through fifth exons encoded 73-, 58-, 53-, 63-, and 53-amino acid sequences, respectively. Donor-acceptor splice sites (GT-AG) were identified at all exon-intron junctions. To better understand the transcriptional regulation of DMRT, DNA walking was used to clone a 1,721-bp sequence from the 5'-flanking region of wrasse testis genomic DNA, and 21 putative regulatory sites were identified. Seventeen regions harboring GATA1, AP4, GATA2, GATAx, Sox5, AP1, C/EBP, Dof2, AP1, STATx, C/EBP, Dof3, GATA1, GATA3, AP1, Dof1, SRY, C/EBP alpha, C/EBP beta, TATA, and CAP binding sites were amplified from the 5'-flanking region. To evaluate transcriptional regulation, 5'-deletion and 5'-flanking region mutants for these 17 regions were constructed, ligated into luciferase-expressing pGL3-Basic or pGL3-Enhancer vectors, and then transiently transfected into Cos-1 and TM4 cells. In both cell lines, pGL3-Enhancer chimeric mutants showed significant regulatory activity, but not pGL3-Basic chimeric mutants. Distal GATA binding sites (-1,721 to -1,362) and the proximal SRY binding region (-330 to -123) were important for transcriptional regulation of the wrasse DMRT gene. Regulatory activities of the distal and proximal regions were 81- and 17-fold higher, respectively, than that of the non-chimeric luciferase vector, which was used as an internal control. Although several DM domain-containing genes have been isolated in fishes, the function and signaling mechanisms of these genes remain unclear. Further studies are required to identify regulators of the DMRT gene and to determine the role of DMRT during sex reversal in protogynous wrasse.

어류에서 생리적, 행동학적, 그리고 기능적 성 역할은 유전적, 사회적, 그리고 다양한 환경적 요소의 영향을 받는다. 어류는 종에 따라, 자웅이체, 동시자웅동체, 그리고 순차적인 성 전환을 일으키는 자성선숙성 자웅동체와 웅성선숙성 자웅동체 등 다양한 성 체제를 가지고 있다. 성 체제 결정에 많은 가변요인들이 영향을 미칠 수 있지만, 성 결정 및 분화 경로에 있어 보편적으로 나타나는 중요한 인자들이 존재한다. 동물의 문 (phyla) 수준에서 보존적인 스테로이드방출세포가 발생초기 단계에 작용하여 pregnenolone을 testosterone으로 전환시키고, 기능적 성 발현을 이끄는 성 호르몬 합성에 작용한다. Androgen과 estrogen을 포함하여, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 11β-hydroxyase, Dax1, Sox9, Wt1, SF1, 그리고 aromatases와 같은 유전자들도 문 (phyla) 수준에서 보존적으로 발견되고 있다. 특히, 포유류에서 처음으로 보고된 SRY 유전자는 성 결정인자로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 어류에서도 포유류의 SRY와 유사한 기능을 갖는 유전자가 발견되었고, Y 염색체상에 존재함으로 인해 DMY라 명명되었다. DMY는 Drosophila melanogaster의 doublesex 유전자와 Caenorhabditis elegans의 mab3 유전자에 공통적인 서열인 DM-domain으로 갖고 있으며, 수컷 특이적인 발현양상을 보인다고 알려진 DMRT의 Y 염색체 복사본이라고 보고된 바 있다. DM-domain을 함유하는 유전자들은 zinc-finger 전사인자로서, 성 발달이나 성 결정에 중요한 역할을 담당한다. 본 연구는 자성선숙성 자웅동체어류인 놀래기 (Halichoeres tenuispinis)에서 성 결정 및 분화의 분자적 기작을 이해하기 위한 기초자료를 제공하기 위하여 수행하였다. 본 연구에서 cDNA library screening 및 RACE 법을 통하여 놀래기 정소에서 DM-domain을 함유하는 유전자의 전체 cDNA 서열을, 난소에서는 일부의 서열을 밝혀냈다. 본 연구에서 분리해 낸 놀래기 DMRT 유전자는 3,119 bp의 크기로서, DM-domain과 male-specific motif를 함유하고 있지만 DMA 및 DMB domain은 없었다. 놀래기의 난소에서 분리해 낸 DM-domain 함유 유전자인 DMO의 부분서열에는 놀래기 DMRT 유전자의 첫 엑손부위와 5'-UTR 영역을 포함하고 있었다. DMO cDNA의 545 bp의 서열 중 212 bp는 놀래기 DMRT 유전자와 100%의 염기서열 상동성을 나타내었다. 놀래기 genomic DNA의 서열과 비교했을 때 놀래기 DMO의 5'-UTR 부위 서열은 두 부분으로 나뉘어졌으나, 상응하는 부위의 염기서열에는 차이가 없었다. 여러 동물에서 보고된 DMRT 단백질들의 아미노산 서열을 비교해 본 결과, DM-domain 영역이 문(phyla) 수준에서 매우 보존적임을 확인할 수 있었다. 아미노산의 3차 구조를 예측한 결과, 놀래기 DM-domain은 Drosophila melanogaster의 doublesex와 사람의 DMRT에 존재하는 DM-domain 영역과 입체적으로 매우 유사한 구조를 갖고 있음을 확인할 수 있었다. DMRT 전사체를 확인하기 위하여 수행한 Northen blot 분석 결과, DMRT cDNA의 크기와 일치하는 약 3.2 kb 크기의 전사체가 정소에서는 검출되었다. 그러나, 난소에서는 전사체가 검출되지 않아, 자성선숙성 자웅동체어류인 놀래기에서 DMRT 유전자는 정소 특이적인 기능을 담당하는 것으로 추론할 수 있었다. Southern blot 분석 결과, 놀래기의 DMRT는 게놈상에 두 개의 좌위에 존재할 것으로 판단되었다. 놀래기 정소의 genomic DNA에서부터 여러 PCR-contig들을 확보하여 DMRT의 cDNA 서열과 상응하게 배열하여 DMRT 유전자 구조를 분석하였다. 그 결과, DMRT ORF 영역이 5개의 엑손과 4개의 인트론으로 구성되어 있음을 확인하였다. 놀래기 DMRT 유전자의 1번 엑손은 73개의 아미노산을 암호화하고 있었으며, 2번 엑손은 58개, 3번과 4번, 그리고 5번 엑손은 각각 53개, 63개, 53개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 또한, 모든 엑손-인트론 연결부위에는 보존된 splicing donor 및 acceptor 서열이 존재하였다. DMRT 유전자의 전사조절에 관여하는 인자들을 확인하기 위하여 Genomic DNA로부터 DNA-Walking 방법을 사용하여 1,721 bp 길이의 5'-flanking 부위를 분리하여 스물 한 곳의 발현조절부위를 예측하였다. 5'-flanking 부위를 주형으로 사용하여 CAP, TATA box, SRY, C/EBP alpha, C/EBP beta, Dof1, AP1, Dof3, GATA1, GATA3, STATx, C/EBP, AP1, Dof2, C/EBP, AP1, sox5, GATAx, AP4, GATA2, 그리고 GATA 1을 부위별로 포함하는 PCR을 수행하였다. 각 PCR 산물을 루시페라아제 발현벡터인 pGL3-Basic, pGL3-Enhancer vector에 cloning하여 DMRT-루시페라아제 혼성체를 구성하였다. 혼성체는 5'-UTR 부위가 조금씩 줄어드는 5'-deletion 방식과 특정 조절부위만을 개별적으로 혼성화시키는 두 방법으로 구성하여 Cos-1 세포주와 TM4 세포주에 각기 주입함으로 그 전사 활성정도를 측정하였다. 두 종류의 세포 모두에서 pGL3-Basic vector 혼성체들은 전사활성을 나타내지 않았다. 그러나, pGL30-Enhaner vector 혼성체들을 전사활성을 나타내었으며, 이를 통해 말단부의 GATA 결합부위와 (-1,721 bp～-1,362 bp) 기저부의 SRY 결합부위가 (-330 bp～-123 bp) 놀래기 DMRT의 발현에 중요한 역할을 담당할 것으로 추측되었다. 말단부 및 기저부를 함유한 혼성 luciferase vector는 비혼성 luciferase vector에 비해, 전사활성이 최대 81배와 17배가 높은 것으로 확인되었다. 다양한 어류에서 DM-domain을 함유하는 유전자들이 보고되고 있지만, 그 기능과 신호전달의 기전은 아직도 분명히 밝혀지지 않았다. 따라서, 앞으로 다른 형태의 성결정 및 분화 관련 유전자들을 포함하여, 정소특이적인 발현을 나타내는 DMRT 유전자의 전사조절 인자를 밝혀내고, 그 작용경로를 밝히는 연구가 필요하다.