Effect of Fucoidan from Undaria pinnatifida on the Induction of Apoptosis in A549 Human Lung Cancer Cells and PC-3 Human Prostate Cancer Cells

Abstract

In the present study, we demonstrated that fucoidan treatment inhibited the growth of PC-3 human prostate cancer cells by inducing apoptosis via the activation of extrinsic and intrinsic apoptosis pathways, the up-regulation of ERK1/2 MAPK signaling pathway, the down-regulation of p38 MAPK, PI3K/Akt and Wnt/β-catenin signaling pathway. Moreover, treatment of fucoidan inhibited metastasis and migration of PC-3 cells by down-regulating expression of NF-κB and MMP-9; and fucoidan regulated MDR-related proteins level by down-regulating TGF-β1, p38 MAPK pathway, HO-1, NF-κB and MRP-1 expressions. Fucoidan can attack cancer cells directly, as well as prevent cancer cells by enhancing immunity. Other polysaccharides including β-glucan (Chan et al., 2009), avemar (Boros et al., 2005), and AHCC (Hirose et al., 2007) do not attack cancer cells directly, even if they prevent cancer cells by improve immunity by increasing B lymphocyte, NK-cell, and macrophage functions. Previous studies have indicated that fucoidan directly inhibited the proliferation of some cancer cells including HS-Sultan (Asia et al., 2005), U937 (Teruya et al., 2007), and HCT-15 (Hyun et al., 2009) cells. Indeed, this study confirmed that fucoidan could directly inhibit the proliferation of PC-3 cells; fucoidan inhibited the growth of PC-3 cells in a dose-dependent manner (Fig. 8), but fucoidan is not toxic to normal RAW 264.7 (Chen et al., 2009) and HEL-299 (Hyun et al., 2009) cells. These results suggested that fucoidan is cytotoxic in a specific manner against cancer cells without cytotoxicity against normal cells. Apoptosis is a highly regulated physiologic mechanism of cell death during homeostasis, disease and development (Ashkenazi, 2008); morphologically characterized by chromatin condensation, membrane blabbing, cell shrinkage, and an increased population of sub-G1 hypodiploid cells (Yang et al., 2007). This study indicated that nuclear morphologic changes as occur during apoptosis is induced by fucoidan treatment (Fig. 9A); treatment of fucoidan (100 ㎍/mL; approximately 0.75 μM) also increased the sub-G1 fraction by 26.27% at 48 h (Fig. 9B) compared with the control. On the other hand, resveratrol is known to induce apoptosis of prostate cancer cells. When PC-3 cells are treated with resveratrol (25 μM for 96 h), the sub-G1 hypodiploid cell population increased by 4.3% compared with the control (Hsieh and Wu, 1999). Compared with resveratrol, fucoidan appears to be more effective in induction of apoptosis in PC-3 cells. Two key molecular signaling pathways lead to apoptotic cell death. The one is the extrinsic pathway, which is activated by death receptor from outside the cell; the other is the intrinsic pathway, which is activated by Bcl-2 protein family and downstream mitochondrial signals from inside the cell (Debatin, 2004). We examined activation of extrinsic and intrinsic apoptosis pathways following to fucoidan treatment. The fucoidan treatment led to activation of DR5 and cleaved caspase-8, a critical component of extrinsic pathway; fucoidan treatment also led to down-regulation of bcl-2, up-regulation of Bax, and activation of caspase-9, an essential component of intrinsic pathway (Figure 10A, B, 11A and B). These results suggested that fucoidan induced apoptosis of PC-3 cells through activation of the extrinsic and intrinsic apoptosis pathway. MAPK pathways are known to regulate apoptosis (Keyse, 2008). Among MAPK proteins, ERK1/2 MAPK is known to promote differentiation, cell survival and cell proliferation (Seger and Kerbs, 1995), but several reports have indicated that activation of ERK1/2 MAPK induce apoptosis (Cheung and Slack, 2004). For example, Cisplatin induced apoptosis in HeLa cells via activation of the ERK pathway (Wang et al., 2000). p38 MAPK is known to be activated by stress to modulate cell differentiation, cell cycle, cell growth, inflammation, and cell death (Bassi et al., 2008); whereas some reports have suggested that p38 MAPK can promote cancer cell growth and survival. For example, docosahexaenoic acid (DHA) induced apoptosis in A549 cells by down-regulation of p38 MAPK (Serini et al., 2008). This study confirmed that fucoidan treatment activated phospho-ERK1/2 MAPK, but diminished phospho-p38 MAPK expression (Figure 12A-D). PI3K/Akt pathway inhibits apoptosis; in the present study, treatment of fucoidan decreased the phosphorylation of Akt (Figure 13A and B). Phosphorylation of Akt is reported to be regulated by p38; our results suggested that down-regulation of p38 MAPK signaling pathway by fucoidan treatment seems to lead to down-regulation of PI3K/Akt signaling pathway. These results suggested that induction of apoptosis by fucoidan was accompanied by activation of ERK1/2 MAPK signaling pathway, as well as down-regulation of p38 MAPK and PI3K/Akt signaling pathway. Fucoidan treatment increased the G0+G1 fraction whereas % of S phase decreased (Figure 9C). Among cell-cycle-related proteins, E2F-1 and p21Cip1/Waf are known to an important role in cell cycle progression from G1 to S phase. The present study indicated that decreased expression of E2F-1 and increased expression of p21 by fucoidan prevented to enter from G1 to S phase (Figure 15A and B); these results also supported result of Fig. 14 that exhibited increase of G1 phase and decrease of S phase by fucoidan. E2F-1 and p21 are regulated by β- catenin, an essential component of Wnt/β-catenin pathway. Wnt/β-catenin signaling plays a pivotal role in the development and progression of prostate cancer. Furthermore, previous study suggested that highly invasive androgenindependent prostate cancer cell lines including PC-3 and DU-145 displayed the higher levels of Wnt/β-catenin signaling compared with the androgen-dependent cell line, LNCaP, and non-cancerous PWR-1E and PZ-HPV-7 prostate cells (Lu et al., 2009). We examined levels of Wnt/β-catenin signaling by fucoidan treatment in PC-3 cells. This study confirmed that fucoidan treatment resulted in decreased expression of β-catenin, an essential component of Wnt/β-catenin pathway. According to previous study that activation of β-catenin is inhibited by GSK-3β, this study demonstrated that treatment of fucoidan inhibited β-catenin through activation of GSK-3β expression (Figure 16A and B). GSK-3β is known to be inhibited by phospho-Akt; thus, we examined expression of phospho-Akt by fucoidan. As a result, fucoidan treatment decreased expression of phospho-Akt (Figure 13A and B). These results suggested that fucoidan treatment inhibited β-catenin through down-regulation of phospho-Akt and activation of GSK-3β expression. We also found that the treatment with GSK-3β inhibitor, LiCl, led to increased level of β-catenin. This result supported the hypothesis that fucoidan could regulate the level of β-catenin via Wnt/β-catenin signaling pathway (Fugure 18A and B). c-myc and cyclin D1 are known to be β-catenin target genes; thus, we examined expressions of c-myc and cyclin D1 following to fucoidan treatment. As results, treatment of fucoidan led to down-regulation of c-myc and cyclin D1 with downregulation of β-catenin (Figure 17A and B). c-myc and cyclin D1 are also known to cellcycle- related proteins. These results might demonstrate that induction of apoptosis and cell cycle arrest by fucoidan were accompanied by down-regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Among prostate cancer cell lines, PC-3 cells are known to migrate to bone; and overexpress of MRP1, multidrug-resistance protein. To treat prostate cancer efficiently, the metastasis and MDR (multidrug-resistance) must be regulated. We examined effect of fucoidan on the metastasis and MDR regulation. Fucoidan treatment reduced NF-κB and MMP-9 expressions (Figure 19A and B); result of wound healing assay also showed that treatment of fucoidan inhibited migration of PC-3 cells compared with the control (Figure 20). According to previous study that MMP-9, metastasis-related protein, is regulated by NF- κB, the results demonstrated that fucoidan treatment inhibited metastasis and migration by inhibiting MMP-9 expression via down-regulation of NF-κB expression in PC-3 cells. Treatment of fucoidan decreased MRP1, multidrug-related protein, expression; furthermore, HO-1 and NF-κB which are known to be over-expressed in resistant cell lines are reduced by fucoidan (Figure 19A, B, 21A and B). In accordance with previous study that TGF-β1 activates HO-1 through p38 MAPK (Ning et al., 2002), and NF-κB is regulated by TGF-β1 (Park et al., 2003) and HO-1 (Hsieh et al., 2008), and MRP1 is known as one of NF-κB target genes (Gazzaniga et al., 2007), the results demonstrated that fucoidan treatment regulated level of MDR-related protein by inhibiting MRP-1 expression through a series down-regulation of TGF-β1, p38 MAPK pathway, HO-1 and NF-κB expression in PC-3 cells(Figure 21A, B, 12A and B). In summary, fucoidan from Undaria pinnatifida induced apoptosis through the activation of ERK1/2 MAPK signaling pathway, down-regulation of p38 MAPK and PI3K/Akt signaling pathway, as well as activation of extrinsic and intrinsic apoptosis signaling pathways. Moreover, the induction of apoptosis by fucoidan was accompanied by downregulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. This study indicated that fucoidan inhibited metastasis and migration via down-regulation of NF-κB and MMP-9 levels; and fucoidan regulated level of MDR-related proteins by down-regulation TGF-β1, p38 MAPK pathway, HO-1, NF-κB and MRP-1 expressions. The results demonstrate that fucoidan might have therapeutic potential for prostate cancer treatment.

Fucoidan은 황산화 L-fucose를 주성분으로 하는 황산화 다당류로서 D-xylose, D-galactose, D-mannose 등의 당과 sulfate, uronic acid 등이 결합한 구조를 가진다. 특히 Undaria pinnatifida로부터 분리된 fucoidan의 경우, 다른 종으로부터 분리된 fucoidan에 비하여, 황산기를 많이 함유하고 있어 생리활성 기능이 더 뛰어난 것으로 확인되었다. 이러한 황산기의 함량은 암세포 증식저해와 비례한다는 사실 또한 밝혀진 바 있다. Fucoidan의 생물학적 효능은 항바이러스 작용, 항혈액응고 작용, 항콜레스테롤 작용, 혈압 상승 억제, 혈당 상승 억제, 항산화작용, 항알레르기 작용 등과 같이 다양하게 알려져 있다. 그러나, fucoidan의 항암 작용에 대한 활성과 그 분자적 기전은 아직 충분히 밝혀지지 않은 실정이다. 현대 질병 중 "암"은 질병으로 인한 사망의 가장 주된 원인으로 꼽히고 있다. 국내에서 암 환자는 2000년에 84,000여 명, 2005년에는 142,1610여 명으로 발병률이 계속 증가하고 있는 추세이며, 암으로 인한 사망도 2000년에 58,000여 명을 넘어서고, 2006년에는 65,909명으로 늘어나고 있다. 또한 전체 사망자 중 암에 의한 사망이 2000년 23.5%, 2005년 25%, 2006년에는 27%로 우리나라 국민 4명 중 1명은 암으로 사망하고 있다는 통계가 나왔다. 암의 대표적인 특징으로는 여러 가지가 알려져 있으나, 특히 세포사멸의 회피와 조직의 침윤성 및 전이성이 중요한 특징으로 나타나게 된다. 세포사멸이란 외부인자의 자극이나 내적인 변화에 의해서 그 세포들이 자발적으로 죽음에 이르는 것을 말하며, 세포사멸 경로는 일반적으로 stress, UV들에 의해 유도되는 내인성 경로와, death-receptor를 통해 신호를 전달하는 외인성 경로가 알려져 있다. 1. 폐암 세포인 A549에서의 fucoidan의 항암 효과 폐암은 최근까지도 남성 사망률의 1위, 여성에서의 사망률도 2위를 차지하고 있어, 폐암의 사망률을 낮추기 위한 연구가 여전히 중요시 되고 있다. 따라서 본 연구에서는 폐암세포 중 하나인 A549를 사용하여 fucoidan의 항암활성을 알아보고자 하였다. fucoidan에 의한 A549세포의 성장 억제효과를 알아보고자 MTT assay를 수행한 결과, fucoidan은 농도 의존적으로 A549세포의 성장을 저해하였다. Fucoidan에 의해 유도되는 세포사멸을 apoptotic body들의 관찰과, sub-G1 peak의 증가를 통해 확인하였다. 세포사멸을 유도하는 신호전달에 중요하게 작용하는 apoptosis 관련 단백질들 (Bcl-2, Bax)과 caspase 관련 단백질들 (Caspase-9, caspase-3, PARP)의 발현을 분석하였다. Fucoidan의 처리는 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현을 농도 의존적으로 감소시킨 반면, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현은 농도 의존적으로 증가시키고 있음을 확인하였다. 또한 Caspase-9과 Caspase-3가 fucoidan의 처리에 따라 활성화되는 것을 확인하였고, PARP의 cleavage를 유도하였음을 관찰하였다. MAPK와 PI3K/Akt 경로는 세포의 생존과 죽음에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있기에, fucoidan에 의해 유도된 세포사멸이 MAPK와 PI3K/Akt 경로와 연관되는지를 분석하였다. Fucoidan 처리에 따라 ERK1/2 MAPK의 인산화가 농도 의존적으로 증가된 반면, p38 MAPK와 Akt의 인산화가 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들로 미루어 보아, fucoidan은 A549 세포에서 Bcl-2를 감소시키고, Bax를 활성화시킴으로써 caspase-9과 caspase-3를 활성화시키고, PARP의 cleavage를 유도하였으며, ERK1/2 MAPK 경로의 활성화와 p38 MAPK 그리고 PI3K/Akt 경로의 감소를 통하여 A549 세포의 세포사멸을 유도할 수 있을 것이라 사료된다. 2. 전립선암 세포인 PC-3에서의 fucoidan의 항암 효과 서구적인 생활양식이 보편화되면서 전립선암의 발병률은 우리나라에서 남성암 중 빠르게 증가하고 있는 암으로 꼽히고 있으며, 그에 따른 사망률 또한 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 따라서 본 연구에서는 전립선암 세포인 PC-3에서 세포사멸의 유도, 전이의 저해, 그리고 다약물내성 관련 단백질들의 조절을 관찰하여 fucoidan의 항암활성을 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 우선 fucoidan이 농도 의존적으로 PC-3 세포의 성장을 저해하는 것을 확인하였다. 그리고 fucoidan에 의해 유도되는 세포사멸을 apoptotic body들의 관찰과, sub-G1 peak의 증가를 통해 확인하였다. Fucoidan에 의해 유도되는 세포사멸이 외인성 세포사멸 경로를 통해 유도되는지 분석한 결과, DR(death-receptor)5와 caspase-8이 fucoidan 처리에 따라 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 내인성 세포사멸 경로에 fucoidan의 효과를 분석한 결과, fucoidan 처리에 따라 Bcl-2는 시간 의존적으로 감소하였으나, Bax는 시간 의존적으로 증가하였다. 또한 caspase-9과 caspase-3가 활성화되는 것을 확인하였으며, PARP의 cleavage 또한 관찰하였다. 이러한 결과들로 미루어 보아, fucoidan은 외인성 세포사멸 경로와 내인성 세포사멸 경로를 통해 세포사멸을 유도하고 있는 것으로 사료된다. PC-3 세포에서 MAPK와 PI3K/Akt 경로에 fucoidan의 효과를 분석한 결과, ERK1/2 MAPK의 인산화가 시간 의존적으로 증가된 반면, p38 MAPK와 Akt의 인산화가 감소되는 것을 확인하였다. 정상세포는 세포분열을 마치면 간기의 G1기에서 정지상태로 존재하지만, 암세포는 자기 조절능력을 잃어서 무한히 세포분열을 반복하기 때문에 세포수가 급격히 증가되어 악성종양을 형성하게 된다. 따라서, fucoidan에 의해 cell cycle arrest가 유도되는지 분석하였다. Fucoidan 처리 시, G0/G1 기는 증가된 반면, S 기는 감소한 것으로 보아, G0/G1 기에서 arrest가 일어나고 있음을 확인하였다. Cell-cycle arrest에 관련된 단백질들의 level에 대한 fucoidan의 효과를 확인한 결과, p21의 발현은 fucoidan의 처리에 따라 시간 의존적으로 증가하였으나, E2F-1, c-myc, cyclin D1의 level은 감소되는 것을 확인하였다. 이들 단백질들은 Wnt/β-catenin 경로의 표적 유전자들로 알려져 있으며, 또한 전립선암 환자들의 경우 Wnt/β-catenin 경로가 증가되어 있다고 알려져 있어 Wnt/β-catenin 경로 관련 단백질들의 level을 알아본 결과, fucoidan은 phospho-GSK3β를 감소시킴으로써, GSK-3β의 활성화를 유도하였으며, β-catenin을 시간 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 그리고 β-catenin이 Wnt/β-catenin 경로를 통해 조절되는지를 명확히 하기 위하여, β-catenin의 상위 조절자인 GSK-3β의 저해제를 사용하여 분석한 결과, 저해제를 처리하지 않은 군에서, β-catenin은 fucoidan 처리에 따라 시간 의존적으로 감소하였으나, 저해제를 처리한 군에서는 β-catenin이 감소되지 않는 것을 확인하였다. 전립선암은 다른 암에 비해 진행속도가 느림에도 불구하고, 많은 환자수와 높은 사망률을 나타내는 것은 뼈로 전이하는 비율이 약 70~80%나 되기 때문이다. NF-κB와 MMP-9이 전이된 세포에서 과발현 되어 있다는 사전보고에 따라 이들 단백질의 발현을 분석한 결과, fucoidan의 처리에 따라 NF-κB 와 MMP-9이 감소되는 것을 확인하였다. 또한 fucoidan이 PC-3 세포들의 migration 을 저해하고 있음도 확인하였다. MDR이란 하나의 항암제에 노출된 암세포가 전에 사용한 적이 없는 구조나 기능이 다른 다양한 항암제에 내성을 보이는 현상을 말한다. PC-3 세포의 경우, MDR 단백질 중 MRP1을 발현한다고 알려져 있어, MDR 단백질의 조절에 fucoidan의 효과를 알아보고자 하였다. MDR에 관련된 단백질의 발현을 확인한 결과, MDR 단백질인 MRP1이 fucoidan 처리에 따라 감소되는 것을 확인하였다. 내성 세포들에 과발현 된다는 HO-1과 NF-κB를 확인한 결과, fucoidan 처리에 따라 감소되는 것을 확인하였다. 또한 HO-1과 NF-κB가 TGF-β1에 의해 조절된다는 보고에 따라 TGF-β1의 발현을 분석한 결과, fucoidan 처리에 따라 TGF-β1이 감소되는 것을 확인하였다. 본 연구에서의 실험결과 및 이전 연구 보고들을 정리하면, Fucoidan은 다음과 같은 작용기전들의 조절을 통하여 PC-3 세포에서 항암활성을 나타내는 것으로 사료된다. 1) Fucoidan은 TGF-β1을 감소시킴으로써, p38 MAPK 경로와 Akt 경로를 감소시키고, 이로 인하여 GSK-3β의 활성화를 이끎으로써, β-catenin의 감소를 유도하여 Wnt/β-catenin 경로의 감소를 야기시켰다. 이로 인하여 Wnt/β-catenin 경로에 의하여 조절을 받는 E2F-1, c-myc, cyclin D1이 감소되고, p21이 증가됨으로써 cell cycle arrest와 세포사멸을 유도할 수 있을 것이라 사료된다. 2) Fucoidan은 DR5 의 활성화를 이끌어 외인성 세포사멸 경로를 통해 세포사멸을 유도할 수 있을 것이라 생각되며, Bax의 활성화를 이끌고 Akt 경로의 감소에 의해 Bcl-2의 감소를 이끌어, caspase-9을 활성화시킴으로써 내인성 세포사멸 경로를 통해 세포사멸을 유도할 수 있을 것이라 생각된다. 3) Fucoidan은 ERK1/2 MAPK 경로의 증가를 초래하였기에, ERK1/2 MAPK 경로의 증가로 인한 세포사멸 또한 유도될 수 있을 것이다. 4) Fucoidan은 TGF-β1과 p38 MAPK 경로의 감소로 인하여, HO-1과 NF-κB가 감소되어, MMP-9의 감소를 이끌 수 있을 것이라 생각되며, 이로 인하여 전립선암 세포의 전이를 저해할 수 있을 것이라 사료된다. 5) 또한 NF-κB의 감소에 의하여 MRP-1이 감소될 수 있을 것이라 생각되며, 이를 통하여 다약물내성 관련 단백질들의 감소를 이끌 수 있을 것이라 생각된다. 6) 그리고 MMP-9이 β-catenin의 직접적인 표적으로 알려져 있기에, Wnt/β-catenin 경로의 감소가 전립선암 세포의 전이를 저해하는데 기여했을 수도 있을 것이라 사료된다. 따라서 본 연구는 이러한 결과들을 바탕으로, fucoidan이 폐암과 전립선암을 치료하는 데 있어 새로운 치료 전략으로 이용 가능함을 시사하는 바이다.