Fermentation of Ecklonia cave and physiological activity change

Abstract

최근 우리는 불규칙한 식습관과 과도한 스트레스, 환경오염 등에 노출되어 살아가고 있다. 이로 인한 면역력 저하는 각종 질병을 유발시키고, 고혈압, 동맥경화, 당뇨 등과 같은 성인병, 그리고 암과 같은 큰 질병에 쉽게 노출되는 원인이 되기도 한다. 따라서 이를 해결하기 위한 방법으로 면역력을 증가시키는 기능성 식품이나 천연의약품의 대한 연구가 활발히 이루어 지고 있는 실정이다. 우리나라는 예로부터 젓갈이나 김치, 청국장 및 막걸리 같은 발효공정을 거친 발효식품을 접하고 있다. 이러한 발효공정은 유용성분의 증가뿐만 아니라 소화력과 흡수율이 증가되고, 잔류농약도 미생물의 작용으로 인하여 유기물질로 분해되며, 한편으로 유익한 세균을 증가시킨다고 널리 알려져 있다. 그로 인해 발효는 식품으로뿐만 아니라 면역증강 같은 의약적인 면에서도 더욱 관심을 받고 있다. 한국의 남해안이나 제주 연안에 서식하고 있는 다시마목(Laminariales)의 다시마과(Alariaceae)에 속한 감태(Ecklonia cava)는 이미 이전 연구들을 통해서 혈압 및 혈중 콜레스테롤의 조정, 항염증, 면역활성 자극효능 및 항균이나 항산화, 항바이러스 같은 생리활성이 검증된 해조류이다. 하지만 추출물의 수율이 낮고, 추출하는 과정에서 많은 유효성분이 버려지고 있으며, 그 성분에 있어 대부분을 차지하는 알긴산이나 후코이단 같은 다당류의 특징상 인체흡수가 용이하지 못하다는 단점을 내포하고 있다. 이러한 문제점의 해결 방안으로 이번 연구에서는 해조류 감태의 발효공정을 수행하는 방법을 연구하였다. 총 3가지의 발효미생물(Lactobacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae 그리고 Candida utilis)를 이용하여 24시간 동안 발효과정을 수행한 발효감태는 부산에 소제한 ㈜마린바이오프로세스에서 보유한 미생물 발효기를 이용하여 발효하였다. 발효감태의 일반성분을 측정한 결과, 일반 감태보다 오히려 당 함량은 줄어들고, 단백질 함량은 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 이것은 발효미생물이 증식함에 따라 단백질 함량이 상대적으로 증가하여 당함량이 줄어든 것으로 보여진다. 이렇게 얻어진 발효감태를 각각 80% 에탄올과 증류수를 이용하여 추출한 결과, 일반감태의 추출물보다 발효감태를 사용한 모든 추출물에서 수율이 1.5 ~ 2배 이상 증가한 것을 확인 하였고, 당성분 함량 또한 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 발효감태 추출물은 일반 감태 추출물보다 폴리페놀의 함량은 감소하였다. 선천면역은 미생물이나 바이러스 같은 외래침입인자가 우리 몸에 들어 오는 것을 방어할 수 있도록 다양한 작용기전을 통해 빠르게 활성화되는 고전적인 숙주방어 형태이다. 그러나 이러한 면역반응이 지속적으로 나타나게 되면, 도리어 조직손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 패혈증과 만성염증을 유발하게 되기도 한다. 내독소로 우리에게 알려진 lipopolysaccaride(LPS)는 그램 음성 균의 세포외막에 존재하여, RAW 264.7 세포와 같은 대식세포 또는 단핵세포에서 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β)와 같은 pro-inflammatory cytokin을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 Nucler transcription factor-kappa B (NF-κB)는 사이토카인, 케모카인, 성장인자 그리고 세포부착 등에 관련된 여러 유전자들의 발현에 중요한 역할을 하는 전사인자로, 활성화된 NF-κB는 iNOS, COX-2, TNF-α그리고 IL-6 등의 여러 염증 매개물질들의 전사를 촉진한다 알려져 있다. 발효감태의 항염증 효과를 알아보기 위해 3가지 발효미생물을 이용하여 발효된 감태의 물 추출물을 RAW 264.7에 처리하여 Nitric oxide (NO)를 측정한 결과, LPS를 자극한 대식세포에서 생성된 NO가 LPS무처리 세포군보다 상당히 증가하였으며, 그것을 기준으로 하여 발효감태들을 처리한 세포군과 비교하였을 때, 약 50%에서 60%까지 NO생성이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서 유산균 발효감태 추출물을 가장 우수한 효과를 보였으므로 선택하여 다음 실험에 사용하였다. 동결 건조된 유산균 발효감태로부터 수율을 높이고 유용성분의 량을 증가시키기 위해, 5종의 당분해효소들과 5종의 단백질 분해효소들을 사용하여 효소추출을 수행하였고, 물을 이용하여 추출한 경우보다 수율이 약 5%에서 35%까지 증가하였다. 또한, 10종의 효소추출물들이 모두 LPS가 유도한 NO생성을 감소시켰으며, 그 중, Viscozyme효소추출물이 가장 높은 효과를 보여 다음 실험을 위해 사용하였다. 발효감태 Viscozyme 효소추출물로부터 유효성분을 좀 더 분리하기 위해 먼저 막분리 시스템을 이용하여 분리하였고, 얻어진 30kDa이상/이하의 분획물을 가지고 LPS가 증가시킨 NO의 생성을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, 두 분획물 모두, NO의 생성을 억제하였으나, 30kDa이상의 분획물이 더 좋은 효과를 보였다. 또한, 30kDa이상의 분획물로부터 에탄올 분획법을 사용하여 다당류 성분을 침전시켜 분리하였고, 분리된 발효감태 유래 다당류 (Fermented E. cava Polysaccharide: FEP)는 농도 의존적으로 NO생성을 상당히 유의성 있게 감소시켰다. LPS의 자극이 유도한 대식세포의 사이토카인의 생성과 PGE2의 생성에 대한 FEP의 억제활성을 확인하기 위해 ELISA를 각각 수행하였고, 염증매개성 인자들의 단백질 발현 양상을 확인하였다. 또한 신호전달 메카니즘을 확인하고자 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, COX-2의 발현에 있어 영향을 주는 PGE2의 생성에 대한FEP의 억제 효과를 확인한 것으로, 농도가 증가할 수록 PGE2가 감소되는 것을 알 수 있었으며, LPS를 대식세포에 처리한 경우, iNOS와 COX2, TNF-α, IL-6 모두 발현이 상당히 증가하였으나, LPS와 함께 FEP를 처리한 경우, iNOS와 TNF-α, IL-6의 단백질 발현이 모든 농도에서 상당히 감소되었다. 그러나, COX-2와 IL-1β 발현에서는 별다른 영향을 관찰할 수 없었다. 한편, FEP가 보인 항염증 반응이 어떤 신호전달에 의해 조절되는 지를 확인하기 위해, NF-κB pathway와 연관된 단백질들의 발현을 확인하였다. 그 결과, LPS를 대식세포에 처리하게 되면, 세포질 내에 존재하는 IκBα의 degradation과 phosphorylation이 유도되었고, 핵 내로 NF-κB가 이동하였다. 그러나, FEP를 처리한 경우, LPS에 의해 유도된IκBα의 degradation과 phosphorylation, NF-κB의 핵 내 이동이 농도의존적으로 상당히 억제한 것을 확인 할 수 있었다. 이것으로부터 유산균 발효감태의 viscozyme효소추출물로부터 분리된 당성분이 LPS가 유도한 대식세포의 활성화에 있어, 활성화된 NF-kB 시그널을 억제함에 따라, iNOS의 발현 및 TNF-α와 IL-6의 생성과 발현을 감소시킴으로써 NO의 생성을 억제하였다는 것을 알 수 있었고, 이것은 FEP가 항염 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 세포에 Gamma ray를 조사하게 되면 생성되는 전자에 의해 물분자와 반응을 통해 ROS를 형성하게 되고, apoptosis관련 단백질들의 발현을 조절함으로써 DNA의 손상을 유도하여 apoptosis를 이끌어 세포의 생존과 증식을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 유산균 발효감태로부터 분리된 당성분이 세포의 생존과 증식에 영향을 미칠 수 있는 지를 확인하기 위해 방사선 조사 실험을 수행하였다. 그 결과로서, 3종의 유산균 발효추출물을 가지고 세포증식에 대한 효능을 평가한 결과, 유산균 발효감태 추출물이 다른 추출물들보다 더 높은 세포 증식을 유도한 것을 확인하였다. 따라서, 유산균 발효감태로부터 제조된 효소추출물들은 무처리 대조군보다 세포의 생존을 증가시켰으며, 이중 Viscozyme 효소 추출물이 가장 높은 효능을 보였다. 발효감태의 효소추출물에서 당성분이 세포의 증식과 생존에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해, 막분리 시스템을 통해 분자량별 분획물을 제조하였고, 그것과 당, 효소 추출물을 가지고 방사선이 조사된 마우스 면역세포에서 생존율과 세포증식효능을 평가하였다. 그 결과, 방사선 조사에 의해 감소된 세포의 생존율과 증식이 효소 추출물 처리에 의해 증가하였으나, 30kDa 이하 분획물은 거의 활성을 보이지 않았다. 그러나, 30kda이상과 당 (FEP)은 효소추출물보다 세포의 생존율과 증식을 더 증가시켰으며, 당성분이 다른 성분들보다 효율적으로 상당히 세포의 생존과 증식을 증가시켰다. 그렇다면 방사선 조사된 세포에서 FEP의 세포 생존과 증식 효능이 초기 발생시키는 ROS의 억제와 연관되는 지를 확인하기 위해, ROS의 양을 확인하였다. 그 결과, FEP을 처리한 경우, 방사선 조사가 유도한 ROS의 생성이 농도 의존적으로 상당히 감소된 것을 알 수 있었다. 다음으로는 FEP가 감소시킨 ROS의 생성에 따른 apoptosis와의 연관성을 확인하기 위해, PI 염색을 수행하였다. 그 결과, 방사선 조사가 유도한 sub-G1내 2n이하의 DNA가 FEP처리에 의해 상당히 감소되었으며, 6시간과 12시간, 24시간 모든 시간대에서 효능을 보였다. 이것으로부터 FEP가 ROS의 생성을 억제하고, 그것이 apoptosis의 한 현상인 DNA 손상을 감소시킨 것으로 여겨진다. 다음으로 앞에서 제시된 FEP의 세포 손상 억제활성과 그 기전을 확인하고자, apoptosis와 연관된 단백질들의 발현을 확인하였는데, 그 결과, 방사선 조사에 의해 증가된 apoptosis유도 단백질인 Bax와 p53의 발현을 FEP의 처리로 인해 감소시켰으며, 방사선 조사에 의해 감소된 apoptosis억제 단백질인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현은 FEP에 의해 증가된 것을 확인하였다. 이것으로부터, FEP가 apoptosis 단백질의 발현을 조절함으로 방사선 조사가 유도하는 세포의 손상을 억제한 것으로 여겨진다. 지금까지의 결과를 보면 감태를 유산균으로 발효하게 되면, 수율과 유효성분이 증가하게 되며, 이에 따라, 항염증이나 방사선 보호효과 등과 같은 생리활성 또한 증가한다는 것을 확인하였고, 이것은 발효감태가 연구적인 가치 뿐만이 아니라 산업적으로도 유용될 수있다는 사실을 이번 연구를 통해 확인하였다.