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GENE IDENTIFICATION, CLONING, EXPRESSION, PURIFICATION AND INDUSTRIAL APPLICATION OF MARINE BACTERIA PRODUCING AGARASES

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Author(s)
오철홍
Issued Date
2009
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000004654
Abstract
In this study, we have identified different agarase producing bacteria, cloning, recombinant enzyme purification of selected agarases, and functional characterization of these enzymes with respects optimum conditions. Additionally, potential further applications of oligomer forms derived from agar were tested with respect to different bioactivities such as whitening, antioxidant and cytotoxic effects.
한천 (agar)은 홍조류의 세포벽에 존재하는 다당류로 agarose 70%와 agaropcetin 30%로 구성되어진다. agarase는 agar 또는 agarose를 분해하는 효소로써 agarose의 galactose 중합체 중 α-1,3 결합을 절단하여 agarooligosaccharide를 생성하는 α-agarase와 β-1,4 결합을 절단하여 neoagarooligosaccharide를 생성하는 β-agarase로 크게 구분되어진다. α-agarase에 생성된 agarooligosaccharide는 apoptosis 유도 활성, 항암활성, 항바이러스 활성, 항산화 활성, 면역 조절 활성, 항알레르기 활성, 항염증 활성 등이 보고되어져 있고, β-agarase에 의해 생성되는 neoagarooligosaccharide는 세균성장 억제, 항산화 활성, 전분노화 방지, 보습효과, 미백효과 등이 보고 되어져 있다.
본 연구에서는 다양한 선택배지를 제작하여 제주 해양 소스로부터 29개의 agarase 생산 균주를 분리하였으며 16s rRNA 유전자 서열을 토대로 유전학적 동정을 실시하였다. 그 결과 Alteromonas sp., Agarivorans sp., Aquimarina sp., Cellulophaga sp., Cytophaga sp., Flammeovirga sp., Glaciecola sp., Microbulbifer sp., Pseudoalteromonas sp., Rhodobacteraceae sp., Ruegeria sp., Reinekia sp., Shewanella sp. 등의 다양한 균주들이 확인 되어졌다.
기존 유전자 데이터베이스에 등록된 agarase 유전자 서열 및 아미노산 서열들을 토대로 하여 다양한 primer들을 제작하였고 각 종들을 대상으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 4개의 균주 (Pseudoalteromonas sp. AG4, Agarivorans sp. AG17, Flammeovirga sp. AG31, Pseudoalteromonas sp. AG52) 로부터 2개의 agarase 유전자 코딩 서열 및 2개의 부분 서열을 확인하였으며, LA PCR을 수행하여 부분서열로부터 전체 코딩서열을 확인하였다. 각각의 agarase에 대한 유전자 분석 결과 Pseudoalteromonas sp. AG4는 63 bp의 신호서열을 포함하는 870 bp의 ORF로 되어있고, GH-16 β-agarase domain (D^(22)~K^(287) aa), active sites (Y69, N^(71), W^(72), W^(139), S^(145), D^(150), E^(153), F^(176), R^(178), E^(257), E^(259)) 및 calcium binding modules (E^(47), F^(48), N^(49), G^(91), A^(92), D^(82), W^(83))을 포함하고 있었으며 33 kDa의 분자량이 진단되어졌다. Agarivorans sp. AG17 agarase는 60 bp의 신호 서열을 포함하는 2988 bp의 ORF로 되어있고 C-terminal 부분에 transmembrane site (G^(968)~L^(990) aa)가 존재하는 것으로 확인 되었으며 Agarivorans sp. JAMB-A11의 agarase와 높은 상동성 (98.6%)을 나타내는 것으로 확인되었다. 진단된 분자량은 107 kDa 이었다. Flammeovirga sp. AG31 agarase는 1446 bp의 ORF로 되어있고 다른 종들의 agarase 유전자 서열들과 비교 했을 때 상동성이 매우 낮았다. ORF에는 GH16- β-agarase domain (R²~T^(36), N^(88)~K^(161) aa), bacterial Ig-like domain 2 (A^(172)~I^(250) aa) 및 carbohydrate binding domain (E^(267)~K^(392), Q^(413)~I^(478) aa)을 포함하고 있었다. Pseudoalteromonas sp. AG52 agarase는 63 bp의 신호서열을 포함하는 870 bp의 ORF가 확인 되었고 GH16-β-agarase domain (D^(22)~K^(287) aa), active sites (Y^(69), N^(71), W^(72), W^(139), S^(145), D^(150), E^(153), F^(176), R^(178), E^(257), E^(259)) 및 calcium binding domains (Q^(47), F^(48), N^(49), G^(91), A^(92), D^(82), W^(83)).이 확인 되었고, 또한 lipo protein을 형성할 수 있는 신호가 포함되어져 있었다.. Aeromonas sp. agarase와 96.8 %의 유전적 상동성을 나타냈으며 분자량은 32 kDa으로 진단되었다.
AG4 agarase mature sequence는 pMal-c2x에 클로닝 하여 E. coli BL21 (DE3)를 숙주로 형질전환이 이루어졌으며 IPTG를 이용해 maltose binding protein이 fusion된 agarase의 발현을 유도하였다. pMAL protein fusion and purification system을 이용하여 단백질을 순수 정제하고 SDS-PAGE를 통해 72.5 kDa의 fusion된 agarase 단백질을 확인할 수 있었다. AG17 agarase mature sequence는 pET16b vector에 클로닝 하여 E. coli BL21 (DE3)를 숙주로 형질전환이 이루어졌으며 IPTG를 이용해 His-tag이 fusion된 agarase의 발현을 유도하고 108 kDa의 fusion agarase를 정제하였다. AG52 agarase는 신호서열이 포함된 것과 포함되지 않은 서열을 각각 pET11a 와 pET16b vector에 클로닝하고 발현을 유도하였다. 신호서열이 포함된 agarase는 발현 양이 미미하여 SDS-PAGE 상에서 확인할 수 없었으나 배양 상등액으로부터 활성을 나타내는 것으로 lipoprotein이 형성되어 세포외로 분비되었음을 확인할 수 있었다. 신호서열이 포함되지 않은 AG52 agarase는 his-tag가 fusion되어 발현이 유도 되었고 정제 후 33 kDa의 fusion 단백질을 확인 할 수 있었다.
각각(AG4, AG17, AG52 agarase)의 최적 조건 및 특성을 분석하기 위해 정제된 agarase를 가지고 최적 온도 및 pH, 열안정성, 금속이온 효과, 기질 분해 특성을 분석하였다. recombinant AG4 agarase는 55 ℃, pH 5.5에서 최적 활성을 나타냈고 40, 45 ℃에서 2시간동안 열 안정성을 나타냈으며 50, 55 ℃에서도 2시간동안 50% 이상의 활성을 유지하였다. AG4 agarase 서열에 cacium binding module이 포함되어 있어 Ca이 열 안정성에 영향을 미칠 것으로 사료되어 CaCl2을 첨가하여 열 안정성 test를 수행하였지만 40, 45, 50 ℃에서는 Ca을 첨가하지 않을 때와 비슷한 열 안정성을 나타냈고, 55 ℃에서는 오히려 감소하는 경향을 나타냈다. 금속이온 효과 분석에서는 Fe에 의해 활성이 약 120% 증가하였고, Cu, EDTA, Zn에 대해서는 뚜렷한 저해를 나타냈다. TLC 분석에서는 agar를 분해하여 최소 4당을 생산하였고 beta agarase type 이였으며 NA4 및 NA6는 분해하지 못했다.
recombinant AG17 agarase는 65 ℃, pH 5.5에서 최적 활성을 나타냈고, 40, 45 ℃에서는 2시간동안 열에 안정하였으며 50 ℃에서도 2시간동안 80% 활성을 유지하였다. 55, 60, 65 ℃ 에서는 2시간 이후 40% 미만의 활성을 유지하였다. 금속이온 test 결과 Mg 이온에 의해 활성이 140% 이상 증가하였고 Cu, Mn, Zn에 의해 저해 활성이 나타났다. TLC 분석 결과 agar를 분해하여 최소 2당 및 4당을 생성하였고 NA4와 NA6 모두 분해하는 것으로 확인되었다.
recombinant AG52 agarase는 55 ℃, pH 5.5에서 최적 활성을 나타냈고, 열 안정성은 40 ℃에서 2시간 후 40%로 감소했다. 45, 50, 55 ℃에서는 30분 후 40% 미만의 활성 만을 나타내며 빠른 감소를 보였다. Ca을 첨가한 후에도 40 ℃에서만 활성이 조금 증가하였을 뿐 나머지 온도에서는 차이를 나타내지 않았다. 금속이온 효과에서는 Fe 이온 및 K 에 의해 활성이 증가하였고, Cu, EDTA, Zn에 의해 강한 저해 활성을 나타내었다. TLC 분석에서는 agar를 분해 후 최소 4당을 생성하였으며 NA4 및 NA6는 분해하지 못했다.
AG 4, 17, 52 agarase의 기질 특이성을 분석한 결과 AG4, AG17 agarase는 agar와 agarose를 비슷한 수준으로 분해하였고 AG52는 agar를 기질로 했을 때 agarose를 기질로 했을때보다 좋은 활성을 나타냈다. 하지만 각각의 agarase로 carrageenan은 분해하지 못했다. agar에 대한 특이 활성은 AG4 가 204.4 unit/mg, AG17 158.8 unit/mg, AG52 105.1 unit/mg으로 나타났다.
AG4와 AG17 agarase를 이용하여 올리고당을 생산 하였으며 최종 생성물은 NA4와 NA2+NA4로 확인 하였고 이를 이용해 항산화, 멜라닌 저해 활성, 세포 독성 등을 확인 하였다. NA4와 NA2+NA4 둘 다 항산화 활성은 나타냈으나 positive control인 비타민 E 에 비해 미미한 활성을 나타냈다. 하지만 melanin 저해 활성에서 NA4가 미백 원료로 많이 사용되어지고 있는 albutin 과 비슷한 활성을 나타내었고 세포 독성이 없어 화장품의 미백 원료로 사용이 가능할 것이라 사료 된다.
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생물공학과
Advisor
이재희
Awarded Date
2009. 2
Table Of Contents
Ⅰ. Introduction = 1
Ⅱ. Materials and methods = 6
1. Isolation of agarase producing bacteria = 6
2. Identification of bacteria using 16s rRNA sequence = 8
2. 1. Genomic DNA isolation = 8
2. 2. 16s rRNA sequence amplification = 8
3. PCR amplification of agarase genes = 9
3. 1. PCR amplification for Agarivorans sp. strains = 9
3. 2. PCR amplification for Cytophaga sp. strains = 10
3. 3. PCR amplification for Psudoalteromonas sp. Strains = 10
4. Long and Accurate Polymerase Chain Reaction (LA PCR) for detection of full length sequence = 12
5. Sequence characterization of agarase genes = 15
6. Cloning and expression of agarase genes = 15
6. 1. 1. Cloning of AG4 agarase coding sequence into the pMAL-c2x expression vector = 15
6. 1. 2. Over-expression and purification of recombinant AG4 agarase enzyme = 18
6. 1. 3. Purification of recombinant AG4 using pMAL protein fusion and purification system = 18
6. 2. 1. Cloning of AG17 agarase coding sequence into the pET16b expressionvector = 19
6. 2. 2. Over-expression and purification of recombinant AG17 agarase enzyme = 21
6. 2. 3. Purification of recombinant AG17 using His Bind purification Kit = 21
6. 3. 1. Cloning of AG52 agarase coding sequence into the pET11a expression vector = 21
6. 3. 2. Over-expression of recombinant AG52 agarase enzyme = 24
6. 4. 1. Cloning of AG52 agarase coding sequence into the pET16b expression vector = 24
6. 4. 2. Over-expression of recombinant AG52 agarase enzyme = 27
7. Biochemical characterization of recombinant agarase = 29
7. 1. Agarase enzyme assay = 29
7. 2. Optimum temperature = 29
7. 3. Optimum pH = 29
7. 4. hermostability = 29
7. 5. Effect of metal ion salts and chelators = 30
7. 6. Identification of reaction products after hydrolysis of agar substrates = 30
8. Industrial application of neoagaro-oligosaccaride = 31
8. 1. Production of neoagaro-oligosaccaride = 31
8. 2. Functional activity of neoagaro-oligosaccaride = 31
8. 2. 1. Antioxidant activity = 31
8. 2. 2. Assay of melanin production = 31
8. 2. 3. Cytotoxicity assay = 32
Ⅲ. = Results
1. Screening and identification of agarase producing bacteria strains = 33
2. Sequence characterization of agarase genes = 37
2. 1. AG4 = 37
2. 2. AG17 = 39
2. 3. AG31 = 42
2. 4. AG52 = 44
2. 5. Sequence comparison and classification of AG4, AG17, AG31 and AG52 = 47
2. 6. Phylogenetic analysis of AG4, AG17, AG31 and AG52 genes = 50
3. Expression and purification of recombinant agarase = 53
3. 1. Purification of recombinant Pseudoalteromonas sp. AG4 agarase = 53
3. 2. Purification of recombinant Agarivorans sp. AG17 agarase = 55
3. 3. Purification of recombinant Pseudoalteromonas sp. AG52 agarase = 57
4. Biochemical characterization of recombinant purified agarases = 59
4. 1. Enzyme characterization of purified recombinant AG4 = 59
4. 1. 1. Effect of temperature on the activity of the recombinant AG4 = 59
4. 1. 2. Effect of pH on the activity of the recombinant AG4 = 59
4. 1. 3. Effect of temperature on the thermostability of the recombinant AG4 = 59
4. 1. 4. Effect of CaCl₂ on thermostability of recombinant AG4 = 59
4. 1. 5. Effect of metal ions salts and chelators on activity of recombinant AG4 = 60
4. 1. 6. Identification of hydrolysis products of the recombinant AG4 on TLC = 60
4. 2. Enzyme characterization of recombinant AG17 = 67
4. 2. 1. Effect of temperature on the activity of the recombinant AG17 = 67
4. 2. 2. Effect of pH on the activity of the recombinant AG17 = 67
4. 2. 3. The effect of thermostability on purified recombinant AG17 = 67
4. 2. 4. Effect of metal ions salts and chelators on activity of recombinant AG17 = 68
4. 2. 5. Identification of hydrolysis products of the recombinant AG17 on TLC = 68
4. 3. Enzyme characterization of recombinant AG52 = 74
4. 3. 1. Effect of temperature on the activity of the recombinant AG52 = 74
4. 3. 2. Effect of pH on the activity of the recombinant AG52 = 74
4. 3. 3. Effect of thermal stability on the activity of the recombinant AG52 = 74
4. 3. 4. Effect of CaCl₂ on thermostability of recombinant AG52 = 74
4. 3. 5. Effect of metal ion salts and chelators on activity of recombinant AG52 = 75
4. 3. 6. Identification of hydrolysis products of the recombinant AG52 on TLC = 75
4. 4. Specific activity of agarases based on to substrate specificity = 82
5. Functional activity of neoagaro-oligosaccarides = 83
5. 1. Antioxidant assay = 83
5. 2. Effect of whitening = 83
5. 3. Effect of Neoagaro-oligosaccharide on cell viability = 83
Ⅳ. Discussion = 86
Ⅴ. References = 92
감사의 글 = 101
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
오철홍. (2009). GENE IDENTIFICATION, CLONING, EXPRESSION, PURIFICATION AND INDUSTRIAL APPLICATION OF MARINE BACTERIA PRODUCING AGARASES
Type
Dissertation
Appears in Collections:
General Graduate School > BMarine Life Sciences
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