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Histopathological and Biological Survey on Marine Bivalve Parasites in Korean Waters

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Abstract
The paramyxean protozoan, Marteilia has been reported to be a causative agent of Marteiliosis or digestive gland disease in oyster and mussel. Histological examination of Manila clam (Ruditapes philippinarum) during routine monitoring in June 2009 revealed that the Manila clam collected from Tongyong (1 out of 40) and Goheung (1 out of 200) infected with Marteilia sp. The parasite located in digestive gland epithelium. The multiplication of tertiary and secondary cells occurred in primary cells formed a group of cell complex containing secondary and tertiary cells in plasmodium. The high intensity of parasite causes disruption of digestive tubule epithelium. The parasite and erosive epithelium were observed in lumen. Marteilia may impact the normal function of digestive gland. However the infected Manila clam in this study did not show remarkable decrease in condition index. Herein we first reported of Marteilia sp. in Manila clam in Korean waters.
1.우리나라 바지락에 발병하는 기생충 및 병리현상 관찰
우리나라 수산 양식업에 있어 중요한 자원인 바지락을 대상으로 기생충 감염 및 병리현상을 관찰하기 위해 2007 년 4 월과 11 월에 서해안, 남해안, 동해안 그리고 제주도 총 23 지역에서 시료를 채집하였다. 지역별로 채집한 40 개체의 바지락을 조직학적 관찰에 사용하였으며, 지리학적 위치에 따른 기생충의 분포 및 감염 양상을 관찰하였다. 그 결과, 서해안과 남해안에서 채집된 바지락은 다른 지역에 비하여 기생충 감염률이 높게 나타났다. 계절별 기생충의 감염률은 차이를 보였으나, 지역에 따른 기생충 감염률의 차이는 없었다. 바지락 시료의 조직학적 관찰에 의해 확인된 기생충들 중, Perkinsus와 Trematode cercariae가 가장 많이 관찰되었다. Perkinsus는 바지락의 모든 기관에서 관찰되었고, 높은 감염률을 보인 개체에서는 혈구 침윤현상을 보였으며, Cercaria의 감염률이 높은 개체에서는 생식소 부분이 관찰되지 않았다. 이밖에 관찰된 기생충으로는 Turbellaria, gregarine, copepod, rickettsia-like organisms, Martelioides와 encysted larval cestode가 관찰되었으며 바지락에 심각한 영향을 끼치지는 않는 것으로 밝혀졌다. 기생충의 발병과 병리현상은 바지락 양식을 하지 않는 제주도와 동해안 지역보다 남해안과 서해안처럼 펄이 잘 형성되고 바지락을 상업적으로 양식하는 지역에서 채집된 개체군이 더 높게 나타났다. 기생충들의 공간적 분포는 서식지의 지형이나 바지락 양식의 밀도와 밀접한 관계가 있는 것으로 사료된다.
2. 난소기생충 (Marteilioides chungmuensis)에 감염된 참굴 (Crassostrea gigas)의 번식생태학적 특성
이 연구는 난소기생충인 Marteilioides chungmuensis 감염에 의한 참굴의 번식 생태학적 특징을 비교하기 위하여 2007 년 12 월 통영에서 채집된 참굴을 분석에 사용하였다. 감염된 개체의 외부 증상은 육질부에 불규칙한 난괴를 형성하고, 난괴 주위에는 투명한 물굴 상태를 나타냈다. 감염된 굴과 비감염된 굴의 습중량은 유의적 차이가 없었다. 조직학적 관찰 결과 M. chungmuensis는 난모세포 안에 기생하며, 초기 및 후기 발달단계 모두 발견 되었다. 감염된 개체는 혈구들의 응집현상도 확인하였다. 감염된 굴들의 성 성숙 관찰결과, 후기발달단계 및 완숙단계를 나타냈지만, 비 감염 개채는 대부분이 소모기 또는 미분화 단계를 보였다. 감염된 알의 비율은 7.45-82.99%였으며, 알의 크기는 24.17±5.59 μm로 정상개체의 알 크기에 비하여 작은 것을 확인할 수 있었다. 감염된 개체를 대상으로 번식량을 측정하기 위하여, 개발된 참굴 알의 다클론항체를 이용하여 ELISA 분석을 실시하였고, 생식소중량지수 (GSI, Gonadosomatic index)는 평균 7.52로 매우 적은 값을 보였다. 감염된 굴의 소화맹낭은 수축된 상태였으나, 소화맹낭 위축도를 측정한 결과 비 감염 굴과 큰 차이를 보이지 않았다. 감염개체와 비 감염개체간의 체조성 성분은 유의적으로 차이가 있는 것을 확인하였다 (p<0.05). 총 단백질은 알이 존재하는 감염된 개체에서 비 감염 개체보다 유의적으로 높은 함량을 보였으나 (p<0.05), 총 탄수화물과 지질의 경우 비 감염개체에서 유의적으로 높게 나타났다 (p<0.05). 참굴 양식에 있어, M. chungmuensis 감염은 전체 생산량 감소 및 경제적 손실을 야기시키며, 지속적인 관찰을 통해 참굴의 건강도에 어떤 영향을 미치는지 확인해야 할 것으로 사료된다.
3. 우리나라 참굴 (Crassostrea gigas), 강굴 (Crassostrea ariakensis), 바지락 (Ruditapes philippinarum)에 발병된 난소기생충, Marteilioides chungmuensis (Paramyxea)
참굴의 주요 병원체인 Marteilioides chungmuensis는 난모세포에 감염하여 질병을 일으키는기생충성 포자충이다. 이 기생충의 진단은 현미경 관찰을 통하여 이루어진다. 2007년에 채집된 참굴, 강굴 그리고 바지락 시료의 조직학적 관찰을 통해 난모세포 안에 1-2개의 포자를 형성하는 단계의 M. chungmuensis를 발견하였다. 이 포자충의 정확한 동정을 위해 PCR 방법을 이용하여 난소포자충의 18s rDNA 유전자 서열을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 cloning과 염기서열 분석을 통해 염기서열을 결정하였고, 결정된 염기서열의 계통학적 유연관계를 분석하였다. 2007년 우리나라에서 채집된 참굴, 강굴 그리고 바지락 시료에서 관찰된 기생충의 조직학적 및 분자생물학적 분석 결과 M. chungmuensis로 확인되었다. 참굴과 바지락의 경우, 이미 우리나라와 일본에서 M. chungmuensis의 발병이 보고된 바 있지만, 강굴은 이 연구를 통해 처음으로 포자충 감염 발생을 확인하였다.
4. Fluid Thioglycollate Medium없이 바지락 (Ruditapes philippinarum)에서의 Perkinsus olseni 휴면포자의 유도
Fluid Thioglycollate Medium (FTM)을 이용한 perkinsus 배양법은 perkinsosis 진단에 널리 사용된다. FTM에서 배양 된 휴면포자는 뚜렷한 형태의 공포 (vacuole)와 세포질 가장자리가 Lugol's iodide에 검은색 또는 검은 갈색으로 염색된 반지형태를 특징으로 하는 구형의 단일핵 세포이다. Perkisus의 생활사 단계는 Perkinsus marinus에서 보고되었으나 P. olseni의 생활사 연구는 아직 미비한 상태로 대부분의 perkinsus 연구가 FTM 배양을 통한 휴면포자에 대한 연구가 주로 이루어졌다. 이 연구에서는 서로 다른 환경에서 바지락의 P. olseni 휴면포자의 형성 단계를 관찰하였다. P. olseni의 감염이 높은 선재와 황도 지역에서 채집된 바지락을 실험에 이용하여 휴면포자의 형성 단계를 조사하였다. 휴면 포자의 형성은 2 M의 NaOH 처리와 Lugol's iodide 염색으로 확인하였다. 살아있는 바지락 (4.29±0.55 um), conical tube와 petridish에서 배양한 바지락 조직, parafilm에 싼 바지락 (패각 포함)에서 작은 휴면포자를 발견하였다. 휴면포자의 성장은 감염된 바지락이 퇴적물에 묻혀 패각 내에서 죽는 현상을 모방한 parfilim에 싼 바지락에서 가장 높았다. 이 방법에 의해 생성된 휴면포자는 28 ℃에서 6 일 배양 후 70 μm까지 성장한 반면 낮은 온도 (4 ℃)에서는 휴면포자의 성장이 저하되었다. 무산소 환경과 부패된 죽은 바지락 조직은 휴면포자의 성장을 촉진시키는 인자인 것으로 사료된다. 휴면포자는 낮은 온도, 낮은 영양상태 및 무산소 환경에서 살아남을 수 있고 해수가 휴면포자의 성장에 필수적인 인자가 아님을 확인하였다. 이 연구에서 바지락의 휴면포자는 perkinsus의 생활사를 연장시키는데 중요한 단계임을 알 수 있었다.
5. 한국 연안에 서식하는 바지락 (Ruditapes philippinarum)에서의 Paramyxean parasite Marteilia sp.의 첫 보고
Paramyxean 원생동물 Marteilia는 굴과 담치에서 Mateiliosis나 소화맹낭 질병을 일으키는 원인 생물로 보고되고 있다. 2009년 6월 전국 바지락 모니터링 중 통영 (40마리 중 1마리)과 고흥 (90마리 중 1마리)에서 Marteilia sp. 에 감염된 바지락이 조직학적 관찰을 통해 발견되었다. Marteilia는 한 세포 내에 2차 또는 3차 세포들이 증식된 형태로 소화맹낭 상피세포에 위치하였다. 기생충에 심하게 감염된 바지락은 소화맹낭 상피세포의 붕괴가 일어났다. Marteilia는 소화맹낭의 정상적인 기능에 영향을 주는 것으로 사료된다. 그러나 감염된 바지락에서 비만도의 뚜렷한 감소는 보이지 않았다. 이 연구는 우리나라 바지락에서의 Marteilia sp. 감염을 처음 보고하는 것이다.
Author(s)
야닌 림파논트
Issued Date
2010
Awarded Date
2010. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000005032
Alternative Author(s)
YANIN LIMPANONT
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
최광식
Table Of Contents
Part Ⅰ Pathologic survey on Manila clams Ruditapes philippinarum in Korean waters 1
Abstract 2
Introduction 3
Materials and Methods 6
1. Sampling efforts 6
2. Histology slide preparation 6
3. Lipofuscin histochemistry 10
4. Gonad development 10
5. Prevalence and infection intensity 10
Results 19
1. Condition index 19
2. Reproductive stage 19
3. Parasite infestation 27
4. Digestive gland condition 56
Discussion 61
1. Condition index, gametogenesis and digestive gland atrophy 61
2. Parasite infestation 62
2.1 Perkinsus 63
2.2 Cercaria trematode 65
2.3 Metacercaria 66
2.4 Marteilioides 68
2.5 Rickettsia-like organism 69
2.6 Gregarine-like organism 70
2.7 Turbellaria 71
2.8 Larval cestode 72
2.9 Copepod 72
3. Digestive gland pathological condition 73
Part Ⅱ Comparative Studies on the Reproduction and Physiological Condition of Marteilioides chungmuensis infected Oyster, Crassostrea gigas from Tongyong, Korea . 76
Abstract 77
Introduction 78
Materials and Methods 80
1. Sampling efforts 80
2. Histology 80
3. Quantification of Marteilioides infected oyster eggs using Enzyme linked Immunosorbent assay (ELISA) 81
4. Biochemical composition analysis 83
Results 83
1. Gross and appearance of the oysters 83
2. Histology 83
3. Egg size 88
4. Digestive gland atrophy index 88
5. ELISA 88
6. Biochemical composition 91
Discussion 92
1. Characteristics of M. chungmuensis 92
2. Quantification of reproductive effort 93
3. Digestive gland atrophy 94
4. Biochemical composition 95
Part Ⅲ Report on the occurrence of Marteilioides chungmuensis (Paramyxea) in Pacific oyster (Crassostrea gigas), Suminoe oyster (Crassostrea ariakensis) and Manila clam (Ruditapes philippinarum) in Korean Waters 97
Abstract 98
Introduction 99
Materials and Methods 102
1. Sample afford 102
2. Histological preparation 105
3. DNA amplication, cloning and sequencing 105
4. Data analysis 106
Results 109
1. Histological morphology 109
2. Molecular analysis 111
Discussion 120
Part Ⅳ Induction of Perkinsus olseni hypnospore in Manila clam Ruditapes philippinarum without fluid thioglycollate medium 123
Abstract 124
Introduction 125
Materials and Methods 129
1. The formation of hypnospores in clam tissue without FTM . 129
2. Comparative study of the growth and number of hypnospore cultured in FTM and incubated in anaerobic induced condition 130
3. Enlargement of hypnospore in different conditions and temperatures 130
4. The presence of hypnospore stage in live Manila clam 131
Results 133
1. The formation of hypnospores without FTM 133
2. Comparative study of the growth and number of hypnospore cultured in FTM and incubated in anaerobic induced condition 133
3. Enlargement of hypnospore in different conditions and temperatures 134
4. The presence of hypnospore stage in live Manila clam 134
Discussion 144
Part Ⅴ First occurrence of the Paramyxean parasite Marteilia sp. in the Manila clam (Ruditapes philippinarum) in Korea 148
Abstract 149
Reference 158
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
야닌 림파논트. (2010). Histopathological and Biological Survey on Marine Bivalve Parasites in Korean Waters
Appears in Collections:
General Graduate School > BMarine Life Sciences
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