Immunomodulatory effects of Ecklonia cava

Abstract

제주도에서 서식하고 있는 해조류는 다양한 색소 성분들을 함유하고 있고, 그 특이적인 색소 성분의 함유 정도에 따라 갈조류, 홍조류, 녹조류로 나누어지게 된다. 이러한 해조류의 생리활성 성분으로는 polysaccharide, fucoidan, polyphenolic compounds (phlorotannins), xanthopophyll, fucoxathin, alginate, vitamins, carotene, thiamin, ascorbic acid, fucans, laminarans 등이 있다. 게다가 동의보감에서는 Ecklonia cava (감태)를 포함하는 갈조류가 방광염, 대장암, 편도염, 안검염, 고환염, 방광염, 결핵, 자궁내막염, 피부염증 (항종 및 등창) 등의 염증성 질환과 아토피 등 면역성 질환에 효능을 보이고 또한 피부면역증강 등의 면역 활성을 가진다고 보고 되어져왔다. 특히, 감태의 생리활성기능으로는 항산화, 항암, 세포 손상에 대한 억제, 항응고, ACE 저해, 지질 과산화 억제, 항균 활성과 MMP 억제 활성 등이 있으나, 면역 반응에 따른 구체적인 연구는 극히 드물다. 따라서 이 연구에서는 갈조류의 한 종류인 Ecklonia cava로부터 단백질 분해효소인 kojizyme에 의한 효소적 가수분해방법을 통해 추출물 (ECK) 을 분리하였고, 그 추출물이 in vitro 와 in vivo 상에서 가지는 면역활성을 확인하기 위해 실험을 수행하였다. 그 결과, ECK는 마우스로부터 얻은 primary splenocytes에서 고농도 (500ug/ml) 에서도 세포독성을 보이지 않았고, 3H-thymidine incorporation assay를 통해 ECK를 처리하지 않은 세포에 비하여 저농도 (3ug/ml)에서도 세포증식능을 가지고, 또한 농도 의존적으로 splenocyte의 증식을 유도함을 알 수 있었다. 그리고 증식된 세포의 표면분자를 이용하여 phenotype을 확인한 결과, ECK를 처리하였을 경우, CD4^(+) cytotoxic T cells은 14.5% (약 1.4배), CD8^(+) cytolytic T cells은 8.4% (약 2배), 그리고 CD45R/B220^(+) pan B cells은 12.1% (약 1.4배)만큼 증가된 것을 확인하였다. 또한 각각의 표면분자를 발현하고 있는 세포의 증식 및 분화 능력을 확인하기 위해 CFSE assay를 수행한 결과, ECK는 CFSE-labeled CD4^(+) T cells과 CD8^(+) T cells은 다소 증가하는 경향이었고, 특히 CFSE-labeled CD45R/B220^(+) B cells이 유의성 있게 증가되었다. 이렇게 ECK에 의해 분화, 증식된 세포에서 사이토카인의 mRNA 발현과 단백질 생성 정도를 확인한 결과에서 우리는 ECK에 의해 Th1 type 사이토카인의 일종인 IL-1β mRNA의 발현양은 다소 감소하였고, TNF-α 와 IFN-mR발현은 유의성 있게 감소하였다는 것을 확인했다. 한편, Th2 type 사이토카인의 일종인 IL-4와 IL-10의 mRNA 발현은 ECK에 의해 증가되었다. 또한 ECK는 비특이적 T cell 자극자인 onA에 의해 자극된 분화, 증식세포에서 분비되는 TNF-α와 IFN-γ 의 생산을 유의성 있게 감소시켰으며, IL-4와 IL-10의 생산은 유의성 있게 증가시켰다. 이상의 결과를 통해, ECK가 세포를 활성화시켜 증식을 유도하고, 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 mRNA 발현과 단백질 생산을 조절하는 면역조절 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다. 이에 따른, ECK에 의한 T, B cell의 활성 기전을 알고자 림프구의 분화, 증식, 활성 및 사이토카인 생성 등에 관여하는 것으로 알려진 NFκB signal pathway를 확인하였다. 그 결과, ECK는 short term과 long term에서 모두 NFκB의 발현을 증가시킴과 동시에 NFκB의 inhibitory protein인 IκB의 인산화를 유도하여 p-IκB의 발현양도 증가시켰다. 반면 NFκB와 p-IκB의 발현양이 증가되는 시간에서는 IκB는 분해되어 발현양이 감소되었다. 게다가 EMSA assay를 통해 ECK는 NFκB DNA binding 활성도 증가시킴을 알 수 있었다. 이상의 결과는 ECK에 의해 유도된 T, B cell의 분화, 증식 및 사이토카인의 분비의 조절이 NFκB pathway에 의한 것임을 제시하였다. 마지막으로 TPA에 의해 마우스의 귀에 유발시킨 피부염증 모델인 mouse ear edema model을 이용하여 ECK가 생체 내에서 항염증 효과를 가지는지를 확인하였다. ECK는 TPA에 의해 유도된 부종과 염증반응을 억제시켜 외이의 피부조직 부종의 범위를 유의성 있게 감소시켰고 (p <0.05), 이들 피부조직에 대한 H&E 염색을 통한 조직학적 소견에서는 현저하게 부종이 감소되고, 피부의 상피 조직에 중성호성 백혈구와 림프구 등의 염증세포의 침윤이 감소함을 알 수 있었다. 또한 외이 조직에서 사이토카인의 생성정도를 관찰한 결과 IL-1β, TNF-α와 IFN-γ 등의 Th1 type cytokine과 염증 매개성 분자인 COX2의 mRNA발현은 감소시켰다. 따라서, 이 연구를 통해 ECK가 Th1 type cytokine과 염증 매개성 분자의 조절을 통해 항염증 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 지금까지의 결과를 종합해 볼 때, ECK는 T cell과 B cell에서 NFκB를 활성화시킴으로써 세포의 증식과 활성화, 사이토카인의 분비를 유도하고, 나아가 Th1 & Th2 type 사이토카인의 생성을 효율적으로 조절함으로써 면역조절 활성효과를 가진다고 할 수 있다. 또한 이 실험에서 사용된 ECK는 해조류로부터 얻은 독성작용이 없는 수용성의 천연물질이기에 면역 반응과 관련된 질병 치료를 위한 시약으로써 사용될 수 있을 것이다.

Ecklonia cava used in this study is a kind of brown seaweeds plentifully found in Jeju Island of Korea. We investigated whether E. cava extract by kojizyme (ECK) has immunological effects on splenocytes in vitro. Here, ECK enhanced the proliferative ability of splenocytes in ^(3)H-thymidine incorporation assay. To identify in detail the specific phenotypes of these proliferating cells, we performed flow cytometry assays and CFSE assay. As a result of ECK treatment, the numbers of CD4^(+) T cells, CD8^(+) T cells and CD45R/B220^(+) cells and the numbers of CFSE-labeled CD4^(+) T cells, CD8^(+) T cells and CD45R/B220^(+) cells increased significantly compared to those in untreated control cultures. In addition, the mRNA expression level of the Th2-type cytokines IL-4 and IL-10, increased compared with that of untreated cells. On the other hand, ECK significantly decreased the level of TNF-α and IFN-γ, i.e., the Th1-type cytokines. In parallel with these results, the production level of Th1-type cytokine was down-regulated, whereas that of Th2-type cytokines was up-regulated by ECK. Overall, this dramatic increase in splenocyte numbers indicated that ECK can induce these cells to proliferate, and can regulate the production of Th1- as well as Th2-type cytokines in immune cells. These results suggest that ECK has the immunomodulatory ability to activate the anti-inflammatory response and/or suppress the pro-inflammatory response. Furthermore, we wanted to identify whether ECK is related to NFκB signal pathway in activated lymphocytes in vitro and has the anti-inflammatory effects in vivo. So, first, we performed western blot and EMSA to identify the nuclear NFκB activation and nuclear NFκB DNA binding activity by ECK. Normally, nuclear factor-κB (NFκB) known as the generic name of a family of transcription factors that function as dimers and regulate genes involved in the immune and inflammatory response. Also, activated NFκB leads to activation, differentiation and proliferation of lymphocytes and secretion of cytokines. Our results showed that ECK induced the translocation of NFκB into nuclear and increased NFκB DNA binding activities in both short term and long term of the classical pathway. These results suggested that ECK activates proliferation, differentiation of lymphocyte and secretion of cytokines by NFκB pathway due to enhance the expression level and NFB DNA binding activity in classical pathway. As the final study, we used TPA-induced mouse ear edema model known as anti-inflammatory model to investigate the anti-inflammatory effects of ECK in vivo. The application of 12-O-tetradecanoylphorbol acetate (TPA) known as a topical activator induces a long-lasting inflammatory response and offers a skin inflammation model appropriate for evaluating anti-inflammatory agents. We performed haematoxylin and eosin (H&E) staining procedure with ear samples to identify whether ECK reduce the histological inflammation responses. Our results showed that ECK reduce histological skin inflammation responses such as decreasing the number of the inflammation cells and inhibiting ear edema similar to dexamethasone used as positive control. In addition, we identified that the mRNA expression level of IFN-γ and TNF-α, a kind of Th1 type cytokines, and COX2, a kind of inducible molecules, was decreased by ECK as compared to the only TPA-treated ear in RT-PCR performed to identify mRNA expression. These results suggested that ECK has anti-inflammation effects in vivo due to inhibit histological skin inflammation responses and the expression level of Th1 type cytokine and inducible molecules. According to these results, this study suggests that ECK has the immunomodulatory effects such as immune activation by increasing stimulation, differentiation and proliferation of lymphocytes due to the activation of NFκB translocation into nuclear and NFκB DNA binding and anti-inflammation effects by decreasing the mRNA and protein expression level of Th1 type cytokines in vitro and histological inflammation response in vivo. So, ECK can be used as a natural agent for therapy of diseases related to immune system.