Molecular Characterization of seven Glutathione-s-transferases from Disk Abalone (Haliotis discus discus), Potential Biomarkers of Endocrine-disrupting Chemicals

Abstract

Glutathione s-transferase (GST)는 GSH 항산화 시스템에 중요한 성분이며, 환경오염물질, 살충제, 항생제, 그리고 세포질내 산화 성분등을 포함하는 electrophile의 phase II detoxification에 중요한 역할을 한다. 수년간, GSTs 활성과 전사 수준은 환경오염 진단을 위한 바이오마커처럼 넓게 측정되어져 왔다. 이 연구에서, 우리는 까막전복의 cDNA library로부터 기존에 GSTs로 알려진 염기서열과 40% 이상 유사성을 나타내는 7개의 GST cDNA 클론을 선택하였다. 7개의 cDNA 클론들은 전체 염기 서열 분석과multiple alignment, phylogenetic 연구를 통해 분석되었으며, 하나의 mu class GST (HdGSTM1), 두 개의 omega class GSTs (HdGSTO1 and HdGSTO2), 세 개의 sigma class GST (HdGSTS1, HdGSTS2 and HdGSTS3), 그리고 한 개의 novel rho class GST (HdGSTR1)로 확인되어졌다. 그 후, 이들 7 개의 GST를 코딩하는 ORF 서열을 pMAL vector 안으로 클로닝하고, E. coli K12 (Tb1)을 이용하여 과잉 발현을 유도하였다. 7개의 재조합 GST들의 효소적 특성은 5가지 전형적인 GST 기질인 1-Chloro-2, 4-dinitrobenzenel (CDNB) 1, 2-Dichloro-4-nitrobenzene (DCNB), ethacrynic acid (ECA), 4-nitrobenzyl chloride (4-NBC)와4-Nitrophenethyl bromide (4-NPB)을 사용하여 분석되어졌다. 부가적으로, Omega GST를 위해 DHA reductase 활성과 thioltrasferase 활성 측정이 수행되었다. HdGSTS3를 제외한 모든 전복 GST들은 특이 기질에 대한 활성을 나타냈다. Rho class GST HdGSTR1는 2.73±0.05 μmol/min/mg, CDNB는 0.35±0.03 μm/min/mg로 ECA에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다. 하지만 mu class GST HdGSTM1는 높은 활성을 나타냈지만 CDNB와 ECA에 대해 1U/mg 보다 낮은 catalytic 능력을 보였다. 두 omega GST들에서, HdGSTO1는 DHA reductase와 thioltransferase활성이 높았지만, 전형적인 GST 기질에 대한 활성은 없었다. 모든 전복 GST들은25 ~ 35 ℃ 온도 범위에서 최적 온도를 나타내었고, 최적 pH는 7.5 ~ 9.0 사이에서 보여졌다. 부가적으로, mu class GST역시 넓은 범위의 온도와 pH에서 안정적으로 나타났다. 전복 GST들의 초기 구조와 그들의 효소활성들 사이의 관계를 설명하기 위해 homology modeling이 수행되어졌다. 전복 GST들을 다른 활성 GST 유전자들과 비교하여 주된 활성 부위에 있는 여러 개의 잔기들이 확인되었고, 서열에 차이를 보였으며 이러한 서열의 차이로 인해 기질과 GST가 결합하는 catalitic 활성이 기존에 GST 활성보다 낮은 것으로 생각된다. 7개의 전복 GST들에 대해 다섯 개의 기관들(아가미, 맨틀, 근육, 소화관, 생식선)에서 조직적 분포를 조사하였다. 다양한 수생 오염물질에 노출된 초기 호흡기관처럼, 음식물의 모든 성분을 흡수하는 그 기관과 생식모세포 발달 장소, 아가미, 소화관, 생식선은 전복 GST들의 발현되는 주된 기관들이었다. 전복의 챌린져 테스트를 위해 세 종류의 endocrine-disrupting chemicals (EDCs), PAH-type chemical β-naphthoflavone, PCB-type chemical aroclor-1254와 한 종류의 TBT-type chemical tributyltin chloride를 저농도와 고농도하에서 사용하였다. 모든 처리구에서 노출 48시간 후, HdGSTM1와 HdGSTO1는 아가미와 소화관에서 의미있게 유도되었다. Rho class GST는 PCB와 TBT 처리구에서만 두 배 이상 유도되어졌다. HdGSTS1는 소화관에서 주로 유도되어졌다. Sigma class에서 가장 높은 활성을 가지는 HdGSTS2는 어떤 처리구에서도 낮게 나타났다. 비활성 isoform HdGSTS3의 발현은 처리구들에서 주로 억제?榮?. 요약하자면, HdGSTM1 와 HdGSTO1은 다양한 스트레스 인자들에 대한 바이오마커 유전자로 사용할 수 있고, HdGSTR1는 PCB와 TBT에 특이적인 바이오마커로 사용할 수 있을 것으로 기대한다.

GSTs (glutathione s-transferases) are a large gene family of detoxification enzyme, whichcontribute to biotransformation of a wide variety of xenobiotics and endogenous oxidative product. In this present study, we identified seven GST genes including one mu class GST (HdGSTM1), two omega class GSTs (HdGSTO1 and HdGSTO2dH), one rho class GST (HdGDTR1) and three sigma class GSTs (HdGSTS1, HdGSTS2 and HdGSTS3), from disk abalone (Haliotis discus discus)cDNA library. The full-length sequence of seven GSTs have been determined, showing over 40% protein sequence similarity with other known GST genes. The modeling structure result also revealed that they shared coincident three-dimentional structures with specific GST subfamily members. The recomibinant protein of seven GSTs fused with maltose binding protein tag was overexpressed in E. coli K12 (Tb1) cells. All the GSTs except for HdGSTS3 displayed detectable activity in enzyme assay. Mu class, rho class and sigma GSTs have specific activity towards two typical GST substrates 1-Chloro-2, 4-dinitrobenzenel (CDNB) and ethacrynic acid (ECA). On the contrary, Two omgea GSTs showed activity of DHA reductase and thioltransferase. The homology modeling revealed that the improper active site and catalytic structures resulted in the low activities of abalone GSTs. Gill, digestive tract and gonad appeared to be the major tissue where abalone GSTs distribute. After waterborne exposure of three endocrine-disrupting chemicals (EDCs) for 48 hrs, HdGSTM1 and HdGSTO1 were significantly induced in both gill and digestive tract by all treatments, exhibiting as potential biomarkers of marine environmental EDCs.