Molecular cloning, expression and characterization of β-agarase I and II from Saccharophagus sp. AG21

Abstract

한천은 홍조류의 세포벽을 구성하는 구성물질로 아가로스와 아가로 펙틴으로 구성되어 있다. Agarose는 1→3결합으로 연결된 β-D-galactose 와 1→4결합으로 연결된 3,6-anhydro-α-L-galactose가 반복하여 존재하는 linear chain이다. 이러한 한천의 미생물에 의한 분해는 agarase에 의하여 일어나는데, agarase는 주로 해양 세균에서 발견되어지며, agarase는 반응 기작에 기초하여 α-agarase와 β-agarase라는 두 가지의 그룹으로 분류 되며, α-1,3-linkages를 가수 분해 하여 agarooligosaccharide를 만드는 효소를 α-agarase, β-1,4 linkages 를 가수분해 하여 neoagarooligosaccharide를 만드는 효소는 β-agarse라고 불리며, β-agarase는 다시 β-agarase I, β-agarase II로 나뉜다. 이 논문에서는 Sachharophagus sp. AG21로부터 두 가지의 agarase agaY1과 agaY2를 cloning 하고 E.coli BL21에서 발현시켰다. 제주 해안에서 채집된 해수로부터 한천분해활성을 나타내는 균주를 분리하였고, 16S rRNA 분석을 통하여 Saccharophagus sp. AG21로 명명하였다. AG21로부터 두 개의 agarase 유전자인 agaY1과 agaY2의 서열분석을 하여 전제 서열을 밝혔다. agaY1은 1908 bp의 nucelotide로 636개의 아미노산을 암호화하며, 69 kDa의 분자량을 가지고 있으며 pH 4.2의 등전점을 가지고 있었다. 이미 보고된 β-agarase I효소들에서 보고된 glycoside hydrolase family 16 domain을 가지고 있으며, 2개의 carbohydrate binding module을 가지고 있었다. agaY2는 전체 길이 2334 base pair의 necleotide로 이루어져 있으며, 778개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 분자량은 88 kDa로 pH 5.2의 등전점을 가지고 있었다. 두 개의 agarase 유전자인 agaY1과 agaY를 각각 pET-16b와 pMAL vector에 cloning 하고 E. coli BL21의 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 유도 하고, 정제하였다. 정제된 재조합 agaY1은 agar를 분해하여 neoagarotetrase와 neoagarohexaose를 생성하여, 서열분석에서 밝혀진 β-agarase I의 특성과 일치하는 결과를 나타내었다. AgaY2는 다른 β-agarse II 타입의 보고된 효소들과는 달리 agar와 agarose를 분해 할 수 없었으나, neoagarotetraose와 neoagarohexaose를 가수 분해 하여 neoagarobiose를 형성하는 β-agarase II의 특성을 나타내었다. AgaY1의 agar분해 활성을 DNS법을 이용하여 측정하였다. AgaY1의 최적온도는 55℃이며, 40℃에서 45℃와 50℃보다 높은 열안정성을 나타내었다. 최적 pH는 7.5로 중성에서 가장 적합한 활성을 나타내었으며, Na^(2+), K^(+)이온의 존재 하에서 30% 이상의 활성이 증가되었고, Fe^(2+)이온의 존재하에서는 40%이상의 활성이 증가되었다. 이러한 결과를 바탕으로 agaY1의 최적 조건하에서 sepecific activity를 분석한 결과 85 U/ug의 specific activity를 나타내었다.

Agarases are important glycoside hydrolases that are generally classified into hydrolase families 16, 50 and 86. Agarses are found to degrade agarose to frequently generate neoagarobiose, neoagarotetraose, or neoagarohexaose as the main products. In this study, we identified agar degrading bacteria Saccharophagus spp. from the sea water sample collected from Jeju Island marine environment. Two beta agarase genes were cloned from Saccharophagus sp. by LA-PCR and respective sequences were named as agaY1 and agaY2, respectively. The agaY1 and agaY2 consist of 1908, 2334 bp open reading frames encoding 636 and 778 amino acids, respectively. The predicted molecular mass of the agaY1, agaY2 were 69 kDa and 88 kDa, respectively. AgaY1 exhibited characteristic GH16-β-agarase domain and carbohydrate binding module. In contrast agaY2 showed characteristic GH42-β-agarase domain. ClustalW pair-wise comparison results revealed that agaY1 and agaY2 have only 12% amino acid identity. The agaY1 and agaY2 recombinant agarases were purified using pMAL protein fusion and purification system. Purified recombinant agaY1 and agaY2 agarases were used to hydrolyse the agar and resulted products were determined by thin layer chromatography (TLC). Results revealed that agaY1 could degrade agar mainly in totetraose and some hexaose components. Incontrast, agaY2 could not able to degrade agar, however it could only degrade the tetraose and hexaoses. Therefore, based on the sequence and functional characterization agaY1 and agaY2 could be classified into beta agarase I and II, respectively. Recombinant agaY1 showed specific activity 5 U/ug. To further functional characterization of purified agaY1, we performed the enzymatic activity assay at different temperature and pH conditions. Results showed that agaY1 optimum temperature and thermal stability at 55 oC and 40oC, respectively. Also, it has optimum pH at 7.5. Additionally, responses on the enzymatic activity were evaluated using different metal ions. Results revealed that Fe^(+2) have higher effect on the activity than K^(+2) ,while Cu^(+2) had not shown any effect on agarase activity. Finally, two agarase genes cloned from Saccharophagus spp. have shown ability to hydrolysis agarose and other neoagarohexaose, neoagarotetraose.