MOLECULAR GENETIC, MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION OF SCUTICOCILIATES ISOLATED FROM MARINE FISH AND DEVELOPMENT OF RECOMBINANT VACCINE AGAINST

Abstract

전 세계적으로 넙치, 돌돔, 자주복 등의 양식어종들로부터 다양한 종의 스쿠티카충이 감염되는 것으로 보고되어져 있다. 본 연구에서는 제주도의 해산어 양식장들로부터 수집된 스쿠티카 종들로부터 은 염색 방법을 이용하여 형태학적 특징을 분석하였으며, 그 결과 6종의 스쿠티카충을 형태, 섬모하부구조, silverline system 등에 기초하여 동정하였다. 각 종들의 형태를 살펴보면 Paranophrys marina는 뾰족한 선단과 둥근 후부를 갖는 가늘고 긴 체형으로 뚜렷하게 긴 membranelle 1(M1)이 몸체의 선단부에 위치하고, paroral membrane (PM)은 M2의 앞까지 신장되어 있다. 10개의 섬모열과 1개의 수축포공이 제2번 섬모열 후단부에 위치하며 한 개의 대핵과 소핵이 몸체의 가운데에 존재하고 있다. Paralembus digitiformis는 선단부에 snout를 갖고 있는 가늘고 폭이 좁은 형 또는 계란형의 체형을 갖고 있다. 뚜렷하게 발달된 membranelle 2(M2)를 포함하는 3개의 membranelle과 M2의 중간까지 뻗어있는 PM이 구강부에 넓게 위치하고 있으며, 21-23개의 섬모열과 한 개의 수축포공이 8번과 9번 섬모열 사이의 후단부에 위치하고 있다. 그리고 한 개의 대핵과 소핵이 몸체의 중간에 위치하고 있다. Miamiensis avidus는 뾰족한 선단과 둥근 후부를 갖고 있는 두터운 난형으로 3개의 membranelle과 두 개로 나뉘어진 PM이 구강부에 위치하고 있었다. 또한, 이종은 평균 13개의 섬모열을 갖고 있으며, 한 개의 수축포공이 제2 섬모열 후단부에 위치하고 있다. Parauronema virginianum는 뭉툭한 선단과 둥근 후부를 갖는 방추형의 체형으로, 구부기관은 거의 비슷한 길이의 M1과 M2를 포함한 3개의 소막과 M2의 중간까지 신장되어 있는 PM이 몸체의 중간부에 위치하고 있다. 이 종은 대개 12-13개의 섬모열과 제2 섬모열의 후단부에 한 개의 수축포공을 갖고 있다. 점차적으로 작아지는 선단과 둥근 후부를 갖고 있는 방추형의 Pseudocohnilembus persalinus는 특이적인 3개의 membranelle과 PM이 구강부에 위치하고 있다. M1과 M2는 서로 평행하며, M3는 PM의 중간에 위치하고 있다. 평균 10개의 섬모열과 한 개의 수축포공이 제2 섬모열 후단부에 존재한다. 길고 가는 선단과 둥근 후부를 갖는 Pseudocohnilembus longisetus는 서로 평행한 두 개의 membranelle과 지그재그형의 PM이 구강부에 위치하고 있다. 평균 9개의 섬모열, 3번과 4번 섬모열에 두 개의 수축포공을 갖고 있으며, 한 개의 대핵과 소핵이 세포의 중앙에 위치하고 있다. 또한, 형태분류된 6종의 스쿠티카충에 대한 유전학적 분석을 수행하기 위해 genomic DNA를 분리하여 SSU rDNA를 PCR 증폭하여 그 염기서열을 결정하였다. 각각의 스쿠티카종으로부터 증폭된 SSU rDNA는 1754~1759 뉴클레오타이드의 염기서열을 갖고 있다. 이들의 염기서열을 이용하여 BLAST program을 이용하여 분석한 결과, 3종의 스쿠티카충은 (M. avidus, P. virginianum, P. persalinus) 이미 알려진 종에 유의하게 일치한 반면, 나머지 3종 (P. marina, P. digitiformis, P. longisetus)은 스쿠티카충에 감염된 병어로부터 새롭게 동정하였다. 이들 서열을 이용하여 계통발생학적 위치를 분석한 결과, 6종의 SSU rDNA는 Philasterida내 단계통군을 형성하였다. Miamiensis avidus는 해산어에 스쿠티카증을 유발하는 주요 기생충성 병원체이다. 본 연구에서는 M. avidus로 부터 38 kDa 항원 단백질에 대한 cDNA와 이 유전자를 이용한 재조합 단백질 생산 및 효능 검증에 관한 연구를 수행하였다. 38 kDa의 항원 유전자는 1096 bp로 294개의 아미노산을 암호화하는 882 bp의 ORF를 갖고 있으며, 이 유전자로부터 예측된 분자량은 29679 Da이다. 아미노산 서열에 기초하여 분석된 단백질의 이차구조는 N과 C 말단에 소수성 영역인 signal peptide와 GPI-anchor addition site를 갖고 있다. 또한 60~267번째 아미노산은 cysteine-rich domain으로 이 영역내 시스테인을 포함한 알라닌, 세린과 리신이 다량으로 존재하고 있다. M. avidus의 38kDa 항원 유전자 단편을 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 조합한 후, pGEX-4T-1 발현 벡터에 클로닝하여 GST 융합 단백질로 발현시켰다. 융합 단백질을 분리하여 38 kDa 항원 단백질의 단클론 항체와 반응시켜 항원성을 확인하였으며, 그 효능을 naive flounder에 면역화하여 스쿠티카충체의 감염시켰다. 그 결과, 감염 24일째 면역화된 그룹의 사망률은 대조구의 60%에 비교하여 10-15%로 낮게 관찰되었다. 또한, 면역화된 그룹의 항체 역가도 대조구보다 높은 OD 수치가 관찰되었다. 이들 결과로부터 GST-ScuAg 융합 단백질은 M. avidus 감염에 대하여 유용한 백신으로써의 사용가능성을 시사하고 있다.

Scuticociliates belonging to the subclass Scuticociliatia are ciliated protozoa, which are frequently occurred in eutrophic coastal or saprobic maricultural waters. They sometimes act as an opportunistic histophagous pathogen and cause an economic loss of mariculture in Asia and Europe. This subclass is divided into three orders namely Philasterida, Pleuronematida and Thigmotrichida (Lynn and Small, 1997). Taxonomical and systematic studies on scuticociliates have been widely carried out on the basis of their morphological and morphogenetic characteristics over the past two decades. Recently, scuticociliatosis is a series of parasite diseases in fresh and mariculture fish, which increases the attention regarding as an important threat element in aquaculture industry. This parasitic disease provokes a severe systemic infection through rapid internal organ infiltration by binary fission and finally induces a mass mortality. To date, several species of scuticociliates have been reported as the causative agents in the disease outbreaks of scuticociliates. In marine fish, Uronema nigricans, Philasterides dicentrachi, Uronema marinum, Pseudocohnilembus persalinus and Miamiensis avidus are well known scuticociliates (Dyvoka and Figueras, 1994; Dragesco et al., 1995; Munday et al., 1997; Iglesias et al., 2001; Jee et al., 2001; Kim et al., 2004a and b; Jung et al., 2005). In addition, Anophryoides haemophila and Mesanophrys chesapeakensis are described in Crustacea (Cawthorn et al., 1996; Messick and Small. 1996). Although several species of scuticociliates have caused serious problems, studies on parasitic disease causative factors are delayed due to the confusion of an imprecise taxonomic system. Since the 1960s with the application of various silver impregnation methods, most of the taxonomic studies on ciliate have progressively changed. Morphological research on the order Scuticociliatia has revealed biological diversity in the ciliates such as species variation as well as physiological and ecological phenotypes (Song and Wilbert, 2002). Silver impregnations help to identify ciliates however, drawbacks such as staining difficulty, misidentification due to species variation, or insufficient data for previously reported strains exist. Molecular methods based on DNA analysis provide additional information to identify phylogenetic relationships and resolve uncharacterized ciliates within the subclass or genus for classical taxonomy. Many genes including small subunit rDNA (SSU rDNA), large subunit rDNA, tubulin, histone, heat shock protein 70 and DNA polymerase α are mostly used to reconstruct phylogenetic trees (Miao et al., 2001). Because the SSU rDNA sequence can be widely used to identify the species, the partial or complete sequences of several protists have been determined. However, the molecular data on scuticociliates are comparatively small and incomplete compared to other ciliates. Therefore, analysis of SSU rDNA and morphological characteristics will discern the taxonomic relationship of unidentified or identified genera. Many researchers have developed effective treatments or protective methods against scuticociliatosis. The previous scuticocilatosis studies focused on an in vitro cultivation (Yoshinaga and Nakazoe, 1993; Iglesias et al., 2003a), infection routes (Parama et al., 2003; Jin et al., 2003), and antigenicity (Iglesias et al., 2003b) in pathologic aspects, drug resistance, and chemotherapeutic material screening (Iglesias et al., 2002; Leiro, et al., 2004; Parama et al., 2004; Parama et al., 2005) in therapeutic research. Although pathologic study provides valuable information to investigate the disease, it does not provide the solution for effective treatment. Vaccination against the parasite is a possible alternative to chemical treatments because fish acquiring immunity against the infective parasite could survive when infected by the parasite (Xu et al., 2006). Research on the vaccination against a few parasitic diseases such as Cryptobia salmositica, Ichthyophthirius multifiliis and Amyloofinium ocellatum has been studied. (Smith et al. 1992; Woo, 1997; He et al., 1997). Recently, the presence of an immobilizaton antigen in P. dicentrachi and its protective effect against challenge infection were demonstrated (Iglesias et al., 2003). Immunization with formalin-killed cells of M. avidus in olive flounder also induced protective immune response against parasites (Jung et al., 2006). These observations provide useful information for recombinant vaccine development. In the present study, we isolated 6 strains of scuticociliates from mariculture farms in Jeju Island. These SSU rDNA sequences and morphological characteristics of ciliates were used to identify and classify their respective phylogeny and to identify major pathogen against scuticociliatosis. M. avidus has been reported as a major histophagous pathogen of scuticociliatosis in olive flounder in Korea. We have previously identified a major antigen protein of 38 kDa of M. avidus by immunoblot assay (unpublished data). Therefore, as the next step in this study, we attemped to develop the vaccine against M. avidus. Here, we cloned and characterized the cDNA of 38 kDa scuticociliate antigen (ScuAg) protein. For gene expression, a fragment of 38 kDa ScuAg gene was synthesized using synthetic oligonucleotides and it induced the protein in a prokaryotic expression system. The fusion protein was purified and its effectiveness on immunized flounder against M. avidus was investigated.