MOLECULAR INSIGHT INTO THE IMMUNE SYSTEM OF THE DISK ABALONE (Haliotis discus discus): cDNA MICROARRAY, TRANSCRIPTIONAL PROFILING AND FUNCTIONAL ASPECTS

Abstract

The innate immune system is the main host defense in abalone like invertebrates. Hence, it is important to understand the immune responses and their mechanisms against different microbial challengers at molecular level. In this study, molecular analysis of immune genes in disk abalone, Haliotis discus discus was investigated using cDNA microarray, transcriptional profiling and functional properties of respective proteins. An abalone 4.2 K cDNA microarray (cDNA chip) was manufactured using the abalone cDNA library clones (ESTs). The cDNA microarray analysis was performed with two immune challenge experiments by injecting 50 μL (5x10^(7)cells/mL) of bacteria mixture (Vibrio alginolyticus, V. parahemolyticus, and Listeria monocytogenes) and 50 μL (1 X 10^(8) pfu/ml) of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV). Transcriptional response of abalone gills, digestive tract, and hemocytes was investigated at 24 h post challenge of bacteria and VHSV. In bacteria challenged abalone, 68 (1.6%) and 112 (2.7%) transcripts were significantly (≥2 or ≤2 -fold) changed in their expression levels in gills and digestive tract, respectively. There were 46 tissue-specific transcripts that were up-regulated only in digestive tract. In contrast, only 13 transcripts showed gill-specific up-regulation. Our results showed that challenge of bacteria, may activate the transcription factors or their activators (KLF, NFIL-3 and Ik-B), inflammatory and apoptosis-related proteins (AIF, TNF-α, archeron), other cytokines (IFN-44-like, SOCS-2) and antioxidant enzymes (glutathione S transferase, TRx-2 and TPx) as a part of the innate immune responses of abalone. Upon VHSV challenge, 280 (6.6%) transcripts were significantly (≥1.5 or ≤1.5 -fold) changed in their expression level of gills and hemocytes compared to respective PBS controls. Total of 88 and 65 genes were up-regulated in gills and hemocytes, respectively. Identified genes were grouped under different immune-functional categories such as inflammatory and apoptosis related genes (TNF super family, Fas ligand), IFN regulatory proteins (IFN-44 like, IFN inducible GTPase), transcription factors (C-jun, NFIL-3) and detoxification proteins (glutathione peroxidase). Considerable number of regulated transcripts were matched with either hypothetical (un-known) sequences or showed no GenBank match (no hit) suggesting that those immune responded transcripts may represent novel genes related to immune system in abalone. Members of TNF super-family play diversified roles in mediating the inflammatory responses, apoptosis and immune regulation. Among them, TNF-α and Fas ligands are considered as multifunctional immune modulators. The gene encoding TNF-α and Fas ligand, which showed up-regulation in microarray results were isolated from abalone cDNA library, denoted as the AbTNF-α and AbFas ligand, respectively. The AbTNF-α and Fas ligand amino acid sequences showed their characteristic TNF family signature and N-terminal transmembrane domains. Phylogenic analysis results showed that AbTNF-α and Fas ligand were closely related with their invertebrate counterparts. qRT-PCR results showed that AbTNF-α and AbFas ligand transcripts were constitutively expressed in abalone hemocytes, gills, mantle, muscle, digestive tract and hepatopancrease in a tissue-specific manner. Transcription level of AbTNF-α and AbFas ligand was significantly (p<0.05) up-regulated in gills and hemocytes by bacteria, VHSV and LPS challenge. The recombinant AbTNF-α and AbFas ligand proteins were over-expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified using a pMAL protein fusion system. Recombinant AbTNF-α and AbFas ligand showed its biological activity by inducing O^(-)₂ in abalone hemocytes and human THP-1 cells. Also, several immune genes such as defensin, SOCS-2, NF-kB have shown marked differences at transcriptional level when abalone hemocytes treated with recombinant AbTNF-α and AbFas ligand. Correlating the transcriptional up-regulation of AbTNF-α and AbFas ligand against bacteria, virus and LPS challenge with the biological activity of two recombinant proteins, we could suggest that the abalone TNF-α and Fas ligand may response to microbial infection by inducing O^(-)₂ like ROS. LITAF and Rel/NF-kB are two important transcription factors which play major role in the regulating inflammatory cytokines, apoptosis and immune related genes. Present study describes the discovery of abalone LITAF (AbLITAF) and Rel/NF-kB (AbRel/NF-kB) homologues and their immune responses. Analysis of AbLITAF sequence shows that it shares characteristic LITAF (Zn^(+2)) binding domain with two CXXC motifs ((82)82CPHC85PHC^(85) and (134)134CPNC137PNC^(137)) with putative peptide of 147 aa. Phylogenetic analysis results further confirms that AbLITAF is a member of LITAF family proteins. AbRel/NF-kB shares numerous signature motifs such as RHD, Rel protein signature ((107)^FRYECR^(112)), DNA binding motif ((103) GLRFFRYEC^(101)), NLS and transcription factor TIG fold similar to their invertebrate and vertebrate counterparts. Tissue specific analysis results showed that both AbLITAF and AbRel/NF-kB mRNA is expressed ubiquitously in all selected tissues in constitutive manner. However, constitutive expression of AbLITAF was higher than AbRel/NF-kB in all tissues except mantle. Upon immune challenged by bacteria and VHSV, AbLITAF showed the significant up-regulation in gills and hemocytes while AbRel/NF-kB transcription was not change significantly. The cumulative data from other molluscs and our data with reference to TNF-α, LITAF, Rel/NF-kB from abalone provide strong evidence that LITAF and NF-kB are independent pathways likely to occur throughout the Phylum mollusc. In the fourth chapter, it describes the gene-encoded two AMPs namely defensin and histone H2A derived AMP as important components of the abalone innate immune response against pathogen invasion. Abalone defensin (pro-defensin) consists of 198-bp coding sequence of putative 66 aa acids which includes the 48 aa mature peptide. The present of invertebrate defensin family domain, arrangement of six cysteine residues and their disulfide linage in C1-C4, C2-C5, and C3-C6, alpha helix in three dimensional structure and phylogenetic relationship suggest that abalone defensin could be a new member of invertebrate defensin family closely related to arthropod defensins. In non-stimulated abalone, defensin transcripts were constitutively expressed in all examined tissues including hemocytes, gills, mantle, muscle, digestive tract and hepatopancreas. Also, abalone defensin transcripts were significantly induced in hemocytes, gills and digestive tract upon bacterial challenge containing V. alginolyticus, V. parahemolyticus and L. monocytogenes. In the second section of chapter four, describes a 40-amino acid AMP designated as "Abhisin" identified from the N-terminus of the abalone histone H2A. Abhisin displays characteristic features of AMPs including net positive charge (+13), higher hydrophobic residues (27%) and 2.82 Kcal/mol protein binding potential. Our results showed that growth inhibition of L. monocytogenes, V. ichthyoenteri bacteria, and fungi (yeast) Pityrosporum ovale by synthetic abhisin at 250 μg/mL. However, stronger activity was displayed against the Gram positive than negative bacteria. Additionally, SEM observation results confirmed that P. ovale cells were damaged by abhisin treatment. Interestingly, abhisin treatment (50 μg/mL) decreased the viability of THP-1 leukemia cancer cells approximately by 25% but there was no effect on the normal vero cells, suggesting that abhisin has cytotoxicity against cancer cells than normal cells. qRT-PCR results revealed that histone H2A transcription was significantly induced after bacteria challenge in abalone gills and digestive tract. Our overall results suggest that defensin and precursor histone H2A or its N-terminal peptide (abhisin) are potent AMPs in disk abalone that could involve in immune defense reactions to increase protection against infections. ROS are highly microbicidal and considered as one of the most important components of host defense of invertebrates against invading pathogens. Antioxidants are potential indicators of oxidative stress due to excessive ROS. Hence, transcriptional responses of antioxidant enzymes could be used as an indicator of oxidative stress (ROS level) as well as infectious status. In order to understand the change of antioxidant enzymes in relation to microbial infection, abalone antioxidant enzymes (Mn-SOD, CuZn-SOD, catalase, TPx, Mt-TRx-2, and SeGPx) transcriptional responses were analyzed after bacteria and VHSV challenge. Results showed that several antioxidant enzymes such as Mn-SOD, catalase, SeGPx, were induced but the responses were shown marked differences at different time points during the immune challenge. Furthermore, it could be suggested that bacteria and VHSV challenge may induce the oxidative stress associated with the activation of phagocytosis and other innate immune defense responses in abalone. In conclusion, the approach to combine the abalone ESTs with cDNA microarray analysis has been resulted for the screening of abalone genes involved in the defense reaction upon a bacteria and VHSV challenge. This approach has good potential for identifying genes as immune markers involved in abalone defenses against different pathogens. Present study clearly showed abalone innate immune system has a number of diversified gene families under different host defense components. Genes and their proteins involved in the disk abalone immunity include sets of TNF-α, Fas ligand, caspase like inflammatory and apoptosis regulators; NF-kB, LITAF, NFIL-3 C-Jun like transcription factors; SOCS-2 and IFN-44 like cytokine regulators; defensin and histone H2A like AMPs and classical set of enzymatic antioxidant genes. Final outcome of this study provides the linkage of evolutional relationship of immune functional genes between invertebrates and vertebrates with better insight into abalone immune defense as a highly complex and diversified system. Further functional studies on these selected immune response genes involved in the abalone host defense mechanisms have to be initiated in future.

전복의 초기 면역 시스템은 다른 무척추동물들에서 처럼 주된 방어체계로 사용된다. 따라서, 분자적 수준에서 다양한 미생물의 공격에 대한 면역 응답 및 그 기작을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구에서는, 까막전복으로부터 면역에 관련된 유전자들을 분자적 수준에서 이해하기 위해 cDNA microarray, 전사 profiling 및 각각의 단백질들에 대한 기능적 특성 분석을 수행함으로써 전복의 면역 응답 체계를 이해하고자 하였다. 본 연구에서는, 까막전복의 cDNA library로부터 4.2 K의 cDNA chip을 제작하였고, cDNA microarray를 이용한 mRNA 차원에서의 전사 수준 분석은 까막전복에 혼합 박테리아 (Vibrio alginolyticus, Vibrio parahemolyticus, Listeria monocytogenes) 50 μL (5x10^(7) cells/mL)와 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) 50 μL (1 X 10^(8) pfu/ml)를 각각 주입하여 면역 공격 실험을 통해 수행하였다. 면역 공격에 대한 전사 응답 반응은 박테리아와 VHSV의 공격 실험 후 24시간째에 아가미, 소화관, 그리고 혈구에서 조사하였다. 박테리아가 공격된 전복에서는, 아가미에서 68개 (1.6%)와 소화관에서112개 (2.7%)의 전사 상의 변화를 확인함으로써 발현 수준의 의미있는 변화(≥2 or ≤2배)를 관찰할 수 있었다. 본 연구의 결과에서는 박테리아 공격에 대한 전복의 초기 면역 반응과 관련하여, 전사인자들 또는 그들의 활성인자들 (KLF, NFIL-3, IK-B), 염증과 apoptosis와 관련된 단백질들 (AIF, TNF-α, archeron), cytokine들 (IFN-44-like, SOCS-2)과 항산화 효소들 (glutathione S transferase, TRx-2, TPx)이 활성화 될 수 있다는 것을 보여주었다. VHSV 공격 실험에서는 PBS를 대조구로 했을 때와 비교하여 아가미와 혈구에서 280개(6.6%)의 의미있는 발현수준의 변화(≥1.5 or ≤1.5배)를 보였다. 아가미와 혈구에서 각각 88개와 65개 유전자의 발현이 증가하였다. 확인된 유전자들은 염증과 apoptosis 관련 유전자 (TNF super family, Fas ligand), IFN 조절 단백질 (IFN-44 like, IFN inducible GTPase), 전사 인자 (C-jun, NFIL-3), 해독 단백질 (glutathione peroxidase)과 같이 면역 기능에 따라 분류하였다. 전사가 조절된 유전자들의 상당수는 기능이 알려져 있지 않거나 GenBank에서 유사한 유전자들을 찾을 수 없었지만, 전복에서의 면역시스템에 관련하는 새로운 유전자들일 가능성을 보인다. TNF super-family에 속하는 단백질들은 염증 반응 조절, apoptosis 및 면역 조절들에 관여하는 다양한 역할을 한다. 그들 사이에서, TNF-α 와 Fas ligand들은 다양한 기능적 면역 조절자처럼 여겨져 왔다. 까막전복으로부터 TNF-α 와 Fas ligand를 코딩하는 유전자들을 AbTNF-α 와 AbFas ligand로 각각 명칭하였으며, microarray 결과들에서 전사 수준이 증가함을 보였다. AbTNF-α 와 Fas ligand의 아미노산 서열들은 TNF family signature와 N-terminal transmembrane domain들을 가지고 있었다. 계통 분석결과, AbTNF-α 와 Fas ligand는 다른 무척추동물의 것과 가까운 관계를 보였다. qRT-PCR 결과, AbTNF-α 와 AbFas ligand는 전복의 혈구, 아가미, 외투막, 근육, 소화관, 간췌장에서 지속적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 박테리아, VHSV와 LPS 공격 실험에 의한 AbTNF-α 와 AbFas ligand의 전사 수준은 아가미와 혈구에서 의미있는 증가(p<0.05)를 보였다. AbTNF-α 와 AbFas ligand 를 코딩하는 유전자는 발현 벡터에 재조합하여, Escherichia coli 에서 재조합 단백질의 과잉 생산을 유도하였고, pMAL protein fusion system을 이용하여 재조합된 단백질을 정제하였다. 재조합 AbTNF-α 와 AbFas ligand 단백질은 전복의 혈구세포와 인간의 THP-1 세포에서 superoxide anion (O^(-)₂) 유도에 의해 생물학적 활성을 나타내었다. 또한, 몇 가지 면역 유전자들은 (defensin, SOCS-2, NF-kB) 전복의 혈구세포에 재조합 AbTNF-α 와 AbFas ligand를 처리했을 때 발현 수준이 다르게 나타나는 것을 볼 수 있었다. 두 재조합 단백질의 생물학적 활성을 통해, 박테리아, 바이러스, LPS의 공격 때와는 반대로 AbTNF-α와 AbFas ligand의 전사 수준이 증가함을 봤을 때, 우리는 미생물 주입했을 때 ROS 처럼 O-2 유도에 의해 전복의 TNF-α 와 Fas ligand가 응답할 수 있다는 것을 제안 할 수 있다. LPS에 유도되는 TNF-α factor (LITAF)와 Rel family nuclear factor kappa B (Rel/NF-kB)는 염증 cytokine들과 apoptosis, 면역 과련 유전자들의 조절에 있어 두 가지 중요한 작용을 하는 전사 요소들이다. 최근 연구에서는 전복의 LITAF (AbLITAF)와 Rel/NF-kB (AbRel/NF-kB) 상관 관계와 그들의 면역 응답에 대한 연구가 진행되었다. AbLITAF의 염기서열 분석결과 147개의 아미노산으로 구성되고 두 개의 CXXC motifs (82CPHC85 and 134CPNC137)를 포함하는 LITAF (Zn^(+2)) binding domain이 확인되었다. 그리고, 계통분석 결과 AbLITAF가 LITAF family 단백질에 속하는 것을 확인할 수 있었다. AbRel/NF-kB는 무척추동물과 척추동물의 것과 유사한 Rel homology domain (RHD), Rel protein signature ((107)^FRYECR^(112)), DNA binding motif ((103)^GLRFFRYEC^(101)), nuclear localization signal (NLS)과 transcription factor immunoglobulin-like fold (TIG) 같은 다수의 domain을 포함하고 있었다. 조직 특이적 분석 결과, AbLITAF와 AbRel/NF-kB의 mRNA 둘 다 모든 선택된 조직들에서 발현이 이루어졌다. 하지만, AbRel/NF-kB보다 AbLITAF에서의 발현 수준이 외투막을 제외한 모든 조직에서 더 높게 나타났다. 다른 연체동물들과 본 연구의 전복 TNF-α, LITAF, Rel/NF-kB 데이터로부터 종합된 결과들은, 연체동물 문 전체에 걸쳐 일어날 수 있는 LITAF와 NF-kB의 독립적인 방향을 강하게 제시할 수 있다. 본 연구의 4장에서는 병원체 감염에 대한 전복의 초기 면역 반응에 중요한 구성 요소로 알려진 defensin과 histone H2A로 명명된 두 개의 항균펩타이드들을 암호화하는 유전자에 대해서 서술한다. 전복의 defensin (pro-defensin)은 66개의 아미노산을 암호화하는 198 bp의 염기서열로 구성된다. 무척추동물의 최근 연구에서 3차 구조 상에 defensin family domain, 6개의 cysteine 잔기의 배열 그리고 그들의 이황화 결합 (C1-C4, C2-C5, C3-C63), alpha helix 구조가 보여졌고, 우리는 전복의 defensin이 다른 무척추동물 defensin의 새로운 member임을 계통적 관계를 통해 제시하였다. 자극을 주지 않은 전복에서, defensin의 전사 수준은 혈구세포, 아가미, 외투막, 근육, 소화관 그리고 간췌장을 포함하는 모든 실험된 조직들에서 지속적으로 발현되어졌다. 또한, V. alginolyticus, V. parahemolyticus와 L. monocytogenes 같은 박테리아 공격 실험 상에서도 전복 defensin의 전사 수준은 혈구세포, 아가미, 소화관에서 의미있게 유도되어졌다. 4장의 두 번째 절에서는 전복으로부터 histone H2A cDNA 유전자를 클로닝하였고, 전복의 histone H2A의 N말단 서열로부터 "Abhisin"를 지칭하는 40개의 아미노산 항균펩타이드를 서열을 확인하였다. Abhisin는 net positive charge (+13), 높은 소수성 잔기들(27%)과2.82 Kcal/mol protein binding potential을 가지는 항균펩타이드들의 특징적인 점을 보여준다. 본 연구에서 합성된 abhisin 을 250 μg/mL 처리했을 때 박테리아 계통인 L. monocytogenes, V. ichthyoenteri와 fungi 계통인 Pityrosporum ovale에 대해 성장을 저해하는 것으로 확인되었다. 하지만, 그람 음성균보다 그람 양성균에 대해 더 강한 활성을 나타내는 것으로 보여졌다. 부가적으로, P. ovale를 대상으로 abhisin을 처리했을 때의 손상 정도를 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 관찰 하였다. 흥미로운 점은, THP-1 leukemia cancer cell에 abhisin을 50 μg/mL 처리했을 때 생존 능력이 약 25% 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 일반 vero cell에는 영향을 나타내지 않았다. 이 결과를 통해 abhisin이 일반 cell보다 cancer cell에 세포 독성을 가진다고 할 수 있다. 그리고, 전복에 박테리아 공격 실험을 수행했을 때 아가미와 소화관에서 Histone H2A 전사 수준이 의미있게 유도되어졌음을 qRT-PCR 결과를 통해 확인할 수 있었다. 종합적인 결과를 봤을 때 defensin과 histone H2A 전구체 또는 그것의 N-말단 아미노산 (abhisin)이 까막 전복에서 강력한 항균펩타이드들이고, 그들은 감염들에 대한 보호체계를 증가시키는 면역 방어 반응에 포함된다고 할 수 있다. ROS는 침입된 병원체들에 대한 무척추동물의 가장 중요한 숙주 방어 요소 중 하나이다. 항산화 인자는 과도한 ROS에 의해 생성되는 산화적 스트레스에 대한 잠재적인 indicator이다. 따라서 ROS 수준의 주입 상태에 따른 항산화 효소들의 전사 수준은 산화적 스트레스에 대한 indicator로 사용할 수 있다. 미생물의 주입에 대해 관계하는 항산화 효소들의 변화를 이해하기 위해, 박테리아와 VHSV 공격 실험 후에 전복 항산화 효소들 [Mn-superoxide dismutase (Mn-SOD); CuZn-superoxide dismutase (CuZn-SOD); catalase; thioredoxin peroxidase (TPx); mitochondrial thioredoxin-2 (Mt-TRx-2); Selenium dependant glutathione peroxidases (SeGPx)]의 전사 수준을 분석하였다. 그 결과, Mn-SOD, SeGPx에서 면역 공격 실험 동안 각각 다른 시점에 뚜렷한 변화를 확인할 수 있었다. 더 나아가, 그것은 전복에서 항산화 효소가 박테리아와 VHSV 공격에 대해 식균 작용 활성과 다른 초기 면역 방어 응답으로 유도될 수 있다는 것을 제시할 수 있다. 본 연구에서는 전복의 cDNA microarray 분석 결과를 가지고 ESTs에 결합하여 접근함으로써 박테리아와 VHSV 공격 실험 상에서 방어 작용에 관계되는 전복의 유전자들을 탐색하였다. 이 접근 방식은 다른 병원체들에 대한 전복의 방어체계에 관계된 유전자들의 확인을 위한 좋은 잠재력을 지닌다. 현재까지 연구에서는 전복의 초기 면역 시스템에 대한 다른 숙주 방어 인자들 하에 다양한 유전자 집단을 보여주었다. 전복의 면역에 관련된 유전자들과 그 단백질들은 염증 및 apoptosis 조절자, 전사 인자들인 NF-kB, LITAF, NFIL-3 C-Jun, cytokine 조절 인자인 SOCS-2와 IFN-44, 항균펩타이드 같은 defensin과 histone H2A 그리고 항산화 효소 등을 포함한다. 결론적으로, 본 연구는 척추동물과 무척추동물간에 면역 기능에 관련된 유전자들의 진화적 관계를 규명하는 단초를 제공한다. 선택된 면역 관련 유전자들에 대해서는 이후에 전복의 면역 방어 기작에 대한 연구를 수행하는데 기여할 수 있다.