Purification and Characterization of Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Enzymatic Digests of Styela plicata

Abstract

Enzymatic digests prepared from Styela plicata by treatment with various proteases including Protamex, Kojizyme, Neutrase, Flavourzyme, Alcalase, Trypsin, α-Chymotrypsin, Protease, Pepsin and Papain, and their the angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activities were investigated. Under the same concentration, the Protamex digest had the highest ACE inhibitory activity (72.21% at 2.5 mg/ml) compared to the other digests. The Protamex digest was performed optimum conditions assay for production of ACE inhibition peptides from S. plicata. The Protamex digest had the highest ACE inhibitory activity by conditions of enzyme concentrations of 10% for 48 h compared to the other conditions. We attempted to isolate ACE inhibitory peptides from Protamex digest of S. plcata using ultra-filtration and ACE inhibitory activity was measured. Below 5 kDa molecular weight fraction showed the highest ACE inhibitory activity (IC_(50) value 0.828 mg/ml). Next, below 5 kDa molecular weight fraction was separated on Sephadex G-25 gel filtration chromatography and ACE inhibitory activity was measured. The F2 peak showed the highest ACE inhibitory activity (IC_(50) value 0.319 mg/ml). The F2 peak was separated on reverse-phase column by high performance liquid chromatography (HPLC) and ACE inhibitory activity was measured. F2-B peak showed the highest ACE inhibitory activity (IC_(50) value 0.076 mg/ml). The F2-B-I from F2-B was divided into single peaks on RP-HPLC. The IC_(50) value of purified ACE inhibitory peptide was 0.014 mg/ml. The results of this study suggested that peptides derived from enzymatic digests of S. plicata would be useful new antihypertension compounds in functional food. However, further work is being carried out to confirm its in vivo physiological effects in blood pressure regulation.

최근 들어 현대인의 성인병으로 크게 대두되는 고혈압은 동맥경화, 뇌졸중, 심근경색 등의 질병을 초래할 뿐만 아니라 뇌출혈과 심장병 및 신장병 등과 합병증으로 나타날 경우 치사율이 매우 높은 질병이다. 이러한 고혈압은 그 자체가 직접적인 증상을 보이지는 않지만 혈압을 정상적으로 유지시키는 일은 위험한 성인병의 발병을 방지하는데 중요하다. 고혈압의 발병과 정상혈압 유지에는 많은 인자가 관여하고 있으며, 인체에서 혈압을 조절하는 기구인 renin-angiotensin system (RAS)의 항상성이 유지되지 않을 때 혈압조절에 문제가 생기는 것으로 알려져 있다. renin-angiotensin system (RAS)에서 renin에 의해 angiotensinogen으로부터 활성화된 angiotensin I을 angiotensin II로 전환시키는데 angiotensin I converting enzyme (ACE, EC 3. 4. 15. 1)이 직접 관여하고 있다고 알려져 있다. 고혈압 억제는 angiotensin I converting enzyme (안지오텐신 전환 효소)의 활성을 억제할 수 있는 물질에 초점이 맞추어져 있다. 이러한 결과로 생성된 angiotensin II는 계속하여 부신과 혈관평활근세포 및 신장 그리고 심장 등에 존재하는 4종의 AT receptor에 작용하며, AT receptor는 혈관수축과 aldosterone 및 vasopressin 방출 그리고 세뇨관의 나트륨 흡수와 신장으로의 혈류량 감소 등을 유발함으로써 심혈관과 신장 및 중추에서 여러 가지 병변을 가져온다. 그리하여 angiotensin I converting enzyme (ACE, EC 3. 4. 15. 1)은 혈관과 심장 및 폐 그리고 뇌조직 등에서 발견되는 dicarboxy peptidase로서 혈압조절 기구인 renin-angiotensin system (RAS)에서 중요한 역할을 한다고 하겠다. 이러한 RAS에서 ACE의 작용으로 심혈관계에 여러 문제가 생기므로 ACE 작용에 대한 저해물질인 ACE inhibitor는 고혈압뿐만 아니라 만성신장병과 동맥경화 및 심장발작 등을 효과 적으로 감소시킬 수 있다. 이러한 ACE 저해제는 captopril, alapril, fosinopril, moexipril 및 tandolapril 등의 화학합성 치료제로 많은 연구가 이루어 졌다. 그러나 이러한 합성 치료제들은 헛기침과 미각장애 및 피부 홍진 등의 부작용이 나타나기 때문에 천연물 유래의 ACE 저해제를 찾는데 많은 관심을 기울이고 있다. 최근에는 다양한 단백질 가수분해물로부터 ACE 저해 peptide를 찾기 위해 많은 연구가 이루어지고 있으며 다양한 해양생물자원을 이용하여 ACE 저해 peptide에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 이 연구의 재료로 사용되어진 주름미더덕(Styela plicata)은 척색동물문, 해초강, 측성해초목, 미더덕과에 속하며 우리나라와 극동 아시아 지역에서 서식하고 있으며, 우리나라 바다 동해와 남해 연안에 주로 분포하며 수심 5-15m의 조하대 바닥이나 각종 고형물에 부착하여 서식하는 독립형 멍게류 이다. 이들은 우리나라에서 양식이 이루어지고 있으며 식용으로 이용하고 있다. 이 연구는 주름미더덕을 이용한 단백질의 효소적 가수분해물을 재료로 하여 ACE 저해 peptide를 찾기 위해 분리와 정제 과정을 통하여 ACE 저해에 직접 관여하는 peptide를 검색하였다. 이 주름미더덕의 단백질 가수분해물에 의한 ACE 저해 peptide를 검색하기 위한 첫 단계는 단백질 가수분해효소 10종을 이용하여 단백질 가수분해물을 제조하고 ACE 저해활성을 측정하여 가장 적합한 효소 Protamex를 선정하고, 선정한 Protamex 효소를 이용하여 가수분해물 제조에 최적 조건을 검색하기 위해 가수분해의 시간과 효소 농도를 다양하게 하여 가수분해물을 제조한 후 ACE 저해 활성을 측정하여 최적의 조건을 선정하였다. 이러한 단계를 거쳐 제조된 단백질 가수분해물을 한외여과와 겔 여과 크로마토그래피 및 RP-HPLC를 이용하여 분리와 정제를 실시하였고 확인된 단일 peptide의 ACE 저해활성을 측정 하였고, 활성을 나타내는 순수 peptide를 분리하기 위한 단계에서는 우수한 ACE 저해활성을 확인 하였고, 보고된 여러 가수분해물 보다 뒤지지 않는 ACE 저해활성이 나타났다. 이러한 결과를 종합하면, 주름미더덕의 단백질 가수분해물은 ACE 저해 효과가 우수하였으며, 이 연구에서 행한 분리와 정제 방법이 효과적이라 판단된다. 천연물 유래의 ACE 저해제를 찾기 위해 이 연구에서 재료로 사용되어진 주름미더덕은 앞에서 언급한 바와 같이 우리나라에서만 양식이 되고 있으며, 또한 식용으로 이용된다. 이들은 항고혈압 기능성 식품으로 개발 된다면 세계적으로 원천기술 확보는 물론 현재 우리나라만이 전적으로 자원을 확보하고 있으므로 세계 시장에서 크게 활용가치를 증진시킬 것으로 판단된다. 이 외에도 주름미더덕은 해양생물 유래 신 혈압개선용 식품소재의 개발과 기존 혈압치료제라는 의약품 개념에서 기능성 식품으로 안전하게 복용이 가능하고 식품용으로 사용 가능한 효소적 추출공정이 적용 되므로 부작용이 없을 것으로 기대된다. 또한 미이용 수산물의 다양한 용도 개발과 해양 생물 산업의 활성화는 물론 최근 세계적으로 해양생물 선호에 따라 개발제품의 수출 증대도 기대 된다.