RAW 264.7 세포에서 산귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka) 과피 추출물과 sinensetin의 항염증 작용

Abstract

제주 재래귤인 산귤 (Citrus sunki Hort. ex Tanaka)의 과피에는 다양한 생리 활성기능을 가진 polymethoxyflavones (PMFs)의 함량이 높다고 알려져 있다. 본 연구에서는 항염증 개선소재로서 산귤 과피의 활용 가능성을 평가하기 위하여 산귤 과피 추출물과 sinensetin의 염증억제 기전을 RAW 264.7 세포에서 분석하였다. 우선 미성숙 및 성숙한 산귤 과피 에탄올 추출물의 DPPH 소거능을 비교한 결과, 미성숙 산귤 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물보다 DPPH 소거능이 양호하였다. 그리고 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화시킨 RAW 264.7 세포에서 산귤 과피 추출물이 여러 염증 매개인자의 생성이 미치는 영향을 분석한 결과, 산귤 과피 추출물은 nitric oxide (NO)와 활성산소종 (ROS)의 생성을 농도 의존적으로 저해하였고, inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) 단백질 발현과 interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 mRNA 발현 역시 저해시켰다. 이러한 활성 또한 미성숙 산귤 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물보다 높은 저해효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 미성숙한 산귤 과피 추출물에 다량 함유된 PMFs 중 sinensetin의 염증 억제 효과와 그 기전을 조사하였다. Sinensetin은 NO 생성과 iNOS, COX-2의 발현을 농도 의존적으로 저해하였다. 그리고 sinensetin은 RAW 264.7 세포에서 extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 와 p38 stress-activated protein kinase (p38) 의 인산화를 감소시켰다. 또한, nuclear factor κB (NFκB) 경로에서 inhibitory κBα (IκBα)의 생성을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, sinensetin은 mitogen activated protein kinase (MAPK)의 인산화 감소와 IκBα의 생성촉진에 영향을 줌으로써 전염증성 매개인자의 생성이 억제되는 것이라 사료된다. 본 연구결과는 산귤 과피의 염증 억제 활성이 과피에 함유되어 있는 PMFs의 다양한 염증 억제기전들이 통합되어 나타난다는 것을 보여주고 있으며, 성숙한 개체와 미성숙한 개체 간 염증 억제효과의 차이는 과실의 성숙 정도에 따른 과피의 PMFs의 함량 변화에 기인한 것이라 사료된다.

The peel of Citrus sunki Hort. ex Tanaka is a rich source of polymethoylflavones (PMFs), which exhibit diverse biological potential. In this study, in order to evaluate the usefulness of C. sunki peel as anti-inflammatory resource, the anti-inflammatory effects of it's peel extracts and sinensetin were investigated in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. Ethanol extract of C. sunki peel (EECP) inhibited nitric oxide (NO) production, inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression in a dose-dependent manner on LPS -stimulated RAW 264.7 cells. These activities are more stronger in inmature peel extracts than mature peel. Also, EECP inhibited the production of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α), in gene expression levels. After then, the anti-inflammatory activity of sinensetin, which was isolated as single compound from C. sunki peel, were assessed. Sinensetin inhibited NO production, the expression of iNOS and COX-2 on LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Moreover, sinensetin promoted the generation of inhibitory kappa B-α (IκBα), and attenuated LPS-induced phosphorylations of MAPKs such as JNK, ERK and p38, which are up-regulators of iNOS and COX-2 protein. These results suggest that the anti-inflammatory effect of sinensetin may be mediated through at least two signal pathways, the regulation of NFκB and MAPKs dependent pathways. Thus, the potent anti-inflammatory effect of EECP may be exerted by combining the anti-inflammatory activities of several PMFs which are contained in EECP.