계대 배양된 사람 지방유래 줄기세포의 안전성 및 하지허혈 동물모델에서 혈관신생에 관한 연구

Abstract

This study was conducted to assess the characteristic of the adult stem cells from adipose tissue and to demonstrate the safety and clinical feasibility of therapeutic angiogenesis. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAdMSCs) were isolated post abdominal liposuction. The hAdMSCs were expanded ex-vivo culture and were found to have the following characteristics: spindle-shaped, tight attachment to the culture dish and self-renewal capacity during a serial passage. Immunophenotypically, these cells were positive for CD73 and CD90, while negative for CD31, CD34 and CD45. The hAdMSCs demonstrated a diverse plasticity including the capacity to differentiate into adiopocytes, osteocytes, neurocytes and myocytes. They also were able to generate sphere formations in the colony-forming assay. Further characterization using karyotyping revealed a normal, euploid set of chromosomes in hAdMSCs up to 12 passages. Toxicity tests for hAdMSCs in SCID mice were conducted. Test groups were divided into saline control group, hAdMSC low dose group (2x10^(5) cells/kg BW), medium dose group (2x10^(6) cells/kg BW), high dose group (2x10^(7) cells/kg BW), and maximum dose group (2x10^(8) cells/kg BW). The cells were administered once intramuscularly and all groups were observed for 13 weeks. The toxicity tests showed no abnormalities. Therefore, a safe quantity for hAdMSCs was determined as 2x10^(8) MSCs/kg BW or higher. To compare tumor occurrence in BABL/c-nu nude mice, MRC-5 (human fetal lung cell line) cells were used as a negative control and A375 (human malignant melanoma cell line) cells were used as a positive control. Test groups were divided into hAdMSC low dose group (2x10^(6) cells/kg BW), medium dose group (2x10^(7) cells/kg BW), and high dose group (2x10^(8) cells/kg BW). The cells were injected subcutaneously one time and all groups were observed for 26 weeks for tumorigenicity. Every subject in the positive control group that was injected with A375 developed tumors and no tumor was found in the negative control group and hAdMSC injected groups. To investigate the distribution of hAdMSCs in the body, the hAdMSCs were marked with CM-DiI fluorescents dye and injected into SCID mice. Test groups were divided into hAdMSC medium dose group (2x10^(6) cells/kg BW) and maximum dose group (2x10^(8) cells/kg BW). After the cells were injected into thigh muscle one time, autopsy and histopathologic examinations were conducted at 24 hours, one week and four weeks. Up to four weeks, the fluorescent marked hAdMSCs were observed in the injected muscles area but not in any other examined organs. The in vitro tube formation assay showed that hAdMSCs formed capillary-like structures on matri-gel under shear stress or certain growth factor conditions. The hAdMSCs took up Dil-labeled acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and positively stained for the von Willebrand factor (vWF), the vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2, KDR) and ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) at the cell surface. Endothelial cells characteristic was also confirmed by analyzing the expression of the endothelial-specific vascular endothelial cadherin (VE-Cadherin) and VEGF receptors 1 (Flt-1) at the mRNA level. A lower limb ischemic model in a BABL/c-nu nude mouse was produced by ligation and dissection the femoral artery and their major branches in the right thigh surgically. Test groups were divided into saline control group, low dose group (1x10^(6) cells/kg BW), medium dose group (5x10^(6) cells/kg BW), and high dose group (1x10^(7) cells/kg BW) and observed for four weeks. Lower limb total amputation rate was 75 % (9 out of 12) for the saline control group and 16.67 % (2 out of 12) for the low dose group. Medium dose groups showed no mouse that had its leg completely amputated. In addition, the high dose group also showed no mouse that had lower limb amputated except one mouse had partial foot amputation. Compared to the saline control group which did not have any mouse whose lower limb healed completely, 7 mice in the low dose group (58.3 %), 6 mice in the medium dose group (50.0 %) and 9 mice in the high dose group (75.0 %) were healed to normal level, validating the effect of hAdMSCs in treating mouse with lower limb ischemia. Also, an increase in neovascularization in proportion to the hAdMSC injection amount was validated from investigating blood flow amount using laser doppler and the number of capillaries per area using alkaline phosphatase dye in the ischemic region. In conclusion, hAdMSCs are easy to obtain, can grow to large quantities, are multipotent and do not involve any ethical problems. Especially, in the case of autologous transplant, the hAdMSCs do not show any toxicity and tumorigenicity. The excellent capability of neovascularization of the hAdMSCs makes them ideal for clinical approaches as a cell treatment for the ischemic blood vessel diseases.

사람의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포 (hAdMSC)를 분리 배양하여 줄기세포의 특성 및 독성여부와 발암성, 그리고 임상적 가능성을 조사하고자 본 연구를 수행하였다. 지방유래 줄기세포는 방추상의 섬유 아세포 모양으로 배양용기 바닥에 길쭉한 모양으로 부착되어 성장하며 계대 배양을 반복하여도 그 형태를 잘 유지되었다. 세포표면 항원을 분석한 결과 CD73, CD90을 발현하였고 CD31, CD34, CD45는 발현하지 않았다. 또한 분화를 유도한 결과 지방세포, 골세포, 신경세포 및 근육세포 등 다양한 세포로 분화되는 것을 관찰할 수 있었으며, colony forming assay를 통해 줄기세포의 특성 중 하나로 알려진 sphere 형성을 확인하였다. 유전적 안전성을 확인하기 위하여 핵형분석을 실시한 결과 12계대에 이르기까지 염색체 이상이 발견되지 않았다. 사람 지방조직 중간엽 줄기세포의 SCID 마우스에서의 독성시험에서 용매대조군 및 hAdMSC 저용량 투여군 (2x10^(5) cells/kg BW), 중간용량 투여군 (2x10^(6) cells/kg BW), 고용량 투여군 (2x10^(7) cells/kg BW), 최고용량 투여군 (2x10^(8) cells/kg BW)으로 설정하고 근육 내로 1회 투여하여 13주간 관찰한 결과, 이상 소견이 관찰되지 않아 hAdMSC의 무해용량은 2x10^(8) cells/kg BW 이상으로 판단되었다. BALB/c-nu 누드마우스에서 종양 발생의 비교를 위하여 음성 대조군으로 MRC-5 (human fetal lung cell line) 세포, 양성 대조군으로 A375 (human malignant melanoma cell line) 세포를 사용하고 hAdMSC 저용량 투여군 (2x10^(6) cells/kg BW), 중간용량 투여군 (2x10^(7) cells/kg BW), 고용량 투여군 (2x10^(8) cells/kg BW)으로 설정한 후 피하로 1회 접종하여 26주 관찰한 발암성 시험 결과, 양성대조 A375 세포를 접종한 모든 개체에서 종양이 발생한 반면, 음성대조 MRC-5 및 hAdMSC를 접종한 모든 개체에서는 종양이 발생하지 않았다. 그리고 줄기세포의 체내 분포 양상을 파악하기 위해 SCID 마우스를 이용하여 CM-DiI 형광 표지된 hAdMSC 중간용량 (2x10^(6) cells/kg BW) 및 최고용량 (2x10^(8) cells/kg BW)으로 시험군을 설정하였다. 대퇴 근육 내로 1회 투여 후 24시간, 1주, 4주에 부검하고 조직 검사를 통해 CM-DiI 형광 표지된 세포를 조사한 결과, 이식부위 근육 조직에서는 4주차까지 형광 표지된 hAdMSC를 관찰할 수 있었으나 그 이외의 장기 조직에서는 확인할 수 없었다. 사람 지방조직 중간엽 줄기세포에 물리적으로 shear stress를 가하거나 특정 성장인자들을 첨가한 matrigel assay에서, in vitro tube formation을 확인할 수 있었고, 면역 형광염색을 통해 혈관 생성과 관련된 KDR, vWF, UEA-1 및 acLDL과 같은 혈관내피세포 특이적 항원을 관찰되었다. 또한 분자생물학적 수준에서 혈관내피세포 특이적인 Flt-1, V-cadherin 등의 발현을 RT-PCR을 통해서 확인하였다. 임상적 가능성을 알아보기 위하여 BALB/c-nu 누드마우스의 오른쪽 다리의 대퇴 동맥 및 복제 동맥을 결찰하고 혈관을 절제하여 수술적으로 하지 허혈 모델을 제작하였다. 용매대조군 및 hAdMSC 저용량 투여군 (1x10^(6) cells/kg BW), 중간용량 투여군 (5x10^(6) cells/kg BW), 고용량 투여군 (1x10^(7) cells/kg BW)으로 하여 4주 동안 비교 관찰하였다. 용매 대조군의 완전 탈락률이 12 마리 중 9 마리로 75 %인데 반해, hAdMSC 저용량 투여군에서 12 마리 중 2 마리로 16.67 %로 낮게 발생하였고 중간용량 및 고용량 투여군에서 다리가 완전히 절단된 개체는 없었다. 더욱이 고용량 투여군에서는 12마리 실험 대상 중 무릎 이하의 탈락 1 례를 제외하고는 하지가 절단된 개체를 발견할 수 없었다. 또한 용매 대조군에서 하지가 완전히 회복된 개체가 전혀 없는데 반해 저용량 투여군에서 7 마리 (58.3 %), 중간용량 투여군에서는 6 마리 (50.0 %), 그리고 고용량 투여군에서 9 마리 (75.0 %)가 정상으로 돌아와 hAdMSC의 효능이 매우 높은 것으로 확인되었다. 또한, 레이저 도플러를 이용한 허혈 부위 혈류량 조사 및 alkaline phosphatase 염색을 이용해 허혈 부위 조직의 단위면적당 모세혈관 수를 조사한 결과에서도 hAdMSC 투여 용량에 비례하여 혈관 신생이 증가함을 확인하였다. 결론적으로, 사람 지방유래 중간엽 줄기세포는 쉽게 얻을 수 있고 대량 증식을 위한 배양이 용이하며 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력 및 윤리적 문제점에서 자유로운 장점을 지니면서도, 특히 자가이식의 경우 독성이 없고 종양을 형성하지 않으며 신생 혈관 조성에 뛰어난 능력을 보이므로 허혈성 혈관 질환에 있어서 세포 치료제로 임상 접근을 하기에 가능할 것으로 판단된다.