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군소알로부터 항암 활성에 관한 연구

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Alternative Title
The Study on anticancer activity from Sea hare (Aplysia kurodai) eggs
Abstract
제주도 연안에 서식하고 있는 군소알로부터 수용성 추출물을 제조하여 in vitro에서의 항암활성과 in vivo에서의 항암활성에 대해 연구하였다.
군소알 (Sea hare eggs)로부터 각 20℃, 40℃와 60℃에서 24시간 동안 처리하여 수용성의 물 추출물 (SHE)을 제조하였다. 그 중, 20℃에서 추출된 SHE가 40℃와 60℃에서 추출된 군소알 물 추출물보다 암세포 증식 억제 활성이 좋은 것으로 확인되었다. 따라서, 20℃에서 추출된 SHE를 항암 활성 실험에 사용하였다.
SHE는 대장암세포인 CT-26, 백혈병 세포인 U-937과 HL-60, 피부암세포인 B-16, 유방암세포인 FM3A에 대한 세포 성장 억제 활성을 측정한 결과, 모든 암세포 종에서 상당한 억제 활성을 보였다. 특히, 혈액암세포인 U-937과 유방암세포인 FM3A에 대한 IC50 값은 각각 10.42 ㎍과 10.62 ㎍으로 다른 암세포들에 비해 상당히 높은 억제 활성을 보였다. SHE를 U-937과 FM3A 세포에 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 핵 응축, apoptotic body 형성, DNA 단편화 및 같은 성상이 증가되어 결국 apoptosis를 유도하였다. Comet assay 결과로부터 SHE의 농도가 증가함에 따라 U-937과 FM3A 세포에서 모두 DNA 손상이 증가되었다는 것을 알 수 있었다. 또한 apoptosis 구간으로 알려져 있는 sub-G1기의 DNA 양이 U-937과 FM3A 세포에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 특히, U-937과 FM3A 세포에 SHE 25 ㎍/㎖과 50 ㎍/㎖를 각각 처리하였을 때, 대조군에 비해 sub-G1기에 해당하는 DNA 양이 각각 약 5 배와 6 배 정도 증가하였다는 것을 확인하였다.
또한, SHE를 U-937 세포에 처리하였을 때, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 상당히 증가되었으나. Bcl-2의 발현은 거의 변화가 없었고, FM3A 세포에 처리하였을 때는 Bax의 발현이 다소 증가하였으나, Bcl-2의 발현은 상당히 감소되었다는 것을 확인하였다. 또한, caspase-3의 발현은 두 세포 모두에서 활성화되었고, cleaved caspase-3에 의해 유도되는 PARP의 활성화는 U-937과 FM3A 세포에서 모두 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가되었다.
In vivo 상에서 FM3A 세포를 투여하여 마우스에서 유방암을 유도하고, SHE의 유방암 종양 크기 억제 효과를 6주간 확인한 결과, 마우스 한 마리당 SHE 30 ㎍과 3 ㎍을 처리하였을 때, 대조군에 비해 종양크기가 상대적으로 감소한 것을 알 수 있었다. 특히, SHE 3 ㎍을 처리한 예방군은 대조군에 비해 약 2 배 정도 유방암의 종양크기 (부피/mm3)를 감소시키는 상당한 효과를 보였다. 또한 예방치료군과 예방군 모두 농도에 의존적으로 종양크기를 감소시키진 않았지만, 대조군에 비해서는 유방암 종양 크기의 감소를 유도한 억제 활성을 확인하였으며, 예방군이 예방 치료군보다 다소 좋은 억제활성을 가졌다는 것을 확인하였다. 항암 활성을 가지는 SHE의 활성 단백질을 찾아내고자 수행한 겔 여과 크로마토그래피로부터는 19개의 분획물이 U-937 세포에 대한 성장 억제 효과를 보였고, 그 분획물을 모아서 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과, 24개의 분획물로부터 암세포 성장 억제 효과를 확인했다. 이렇게 얻은 24개의 분획물을 가지고 mono Q sepharose column을 이용하여 분획물을 정제하였고, 그것을 가지고 단백질 분자량을 확인한 결과, 20 kDa 부근과 30 kDa 부근 등 SHE의 30 kDa 이상 분획물이 함유하고 있는 단백질들과 유사함을 보여주었으나, 14 kDa과 66 kDa의 분자량 부근에서 새로운 단백질 분자량들이 확인되었다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, SHE가 혈액암세포와 유방암세포에 대하여 apoptosis를 유발하여 성장 및 활성을 억제한다는 것을 확인할 수 있었고, 동물실험으로부터 예방처리하였을 때 유방암 종양 크기를 가장 많이 억제하였다는 것을 확인하였다. 따라서, 군소알로부터 유래한 추출물은 다양한 암세포에 대한 강력한 항암효과를 확인하였기 때문에 향후 해양 천연물 유해 항암 소재로서 충분히 이용 가능할 것으로 사료된다.
Sea hare (Aplysia kurodai), belonging to the order Opistobranchia, subclass Gastropoda, is a marine shell-less snail. Recently, due to the bioactive molecules such as peptide or glycoprotein, and then their biomedical abilities including antitumor, antimicrobial, and antibacterial effect we have tried to prepare water-soluble extract from sea hare eggs (SHE: sea hare egg extract) and investigated its anticancer activities in vitro and in vivo.
On the antitumor exmaination, strong antitumor activities of SHE were observed for the growth of the five tumor cell lines such as CT-26 (mouse colon carcinoma cell line), U-937 (human monoblastoid leukemia cell line), HL-60 (human promyelocyte leukemia cell line), B-16 (murine melanoma cell line) and FM3A (human breast cancer cell line) and their IC50 values were between 10 and 20 ug/㎖, but around 80 ug/ml for the growth of normal cell line (V79-4). Especially SHE showed the strongest inhibitory effects against the growth of U-937 and FM3A tumor cells (IC50 10.42 ug/㎖ and 10.62 ug/㎖, respectively). SHE induced dose-dependantly apoptosis, which formed apoptotic body, induced DNA damage and DNA fragmentations, and increent of sub-G1 DNA contents in U-937 and FM3A cells. In addition, SHE significantly or weekly increased the expression of Bax (pro-apoptotic protein), whereas slightly or significantly decreased the expression of Bcl-2 (anti-apoptotic protein) with the increment of concentrations in U-937 or FM3A cells, respectively. Additionally, SHE stimulated the activation of caspase 8, caspase 3, and PARP in the tumor cells.
These results indicated that SHE induced apoptosis via caspase pathway for anticancer activities in vitro (U-937 and FM3A cells).
In animal model, SHE administration via intradermal injection (i.d.) significantly suppressed the tumor growth induced by the treatment of FM3A cells. Especially, antitumor effect of SHE in the experimental tumor rats induced by FM3A tumor injection was dramatically observed even at a dose of 3 ㎍/mouse by around 50% inhibition.
In order to identify the antitumor active compounds from SHE, the water-soluble extract of SHE was separated to the four fractions with different molecular weights under a ultrafiltration membrane separation system, and then 30 kDa < fraction was selected. The fraction was applied to a gel filtration and an anion exchange chromatography, and then the antitumor active fractions were taken on mono Q Sepharose anion exchange chromatography. The fractions were pooled and concentrated and then applied to SDS-PAGE. Five bands were observed on near 20.1 kDa and 30 kDa, between 30 kDa and 45 kDa, and 97 kDa molecular weight respectively.
According to these results, it was found that SHE strongly inhibited the tumor growths, differentiation, and proliferation of U-937 and FM3A cells as eliciting apoptosis via caspase pathway and decreased the breast tumor size in vivo. Therefore, this present study suggests that SHE might be a strong potential anticancer agent and it will be expected as a novel antitumor drug.
Author(s)
김원석
Issued Date
2008
Awarded Date
2008. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000004275
Alternative Author(s)
Kim, Won Suk
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생물공학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
ABSTRACT = 1
요약 = 3
서론 = 5
재료 및 방법 = 9
2.1. 재료 = 9
2.2. 군소알의 일반성분 분석 = 9
2.3. 군소알 물 추출물 (SHE) 제조 = 9
2.4. 암세포배양 = 9
2.5. In vitro 실험 = 11
2.5.1. 암세포 증식 억제 억제율과 IC50 측정 = 11
2.5.2. 형광현미경을 이용한 cell의 형태적 관찰 = 11
2.5.3. 전기영동을 이용한 암세포의 DNA 단편화 측정 = 12
2.5.4. Alkaline comet assay를 이용한 암세포의 DNA 손상 측정 = 12
2.5.5. Flow cytometry analysis (FACS)를 이용한 세포 주기 측정 = 13
2.5.6. 세포로부터 세포질 단백질의 추출 = 14
2.5.7. Western blot assay에 의한 apoptosis 관련 단백질의 발현 측정 = 14
2.5.8. Caspase-3 활성의 측정 = 15
2.5.9. 통계분석 = 15
2.6. 동물실험 = 15
2.6.1. 실험동물 = 15
2.6.2. 실험물질 제조 및 유방암세포 투여 = 16
2.6.3. 투여 경로 및 투여 회수와 방법 = 16
2.6.4. 결과 측정 = 16
2.6.5. 통계분석 = 19
2.7. SHE로부터 활성 물질 분리 = 19
2.7.1. SHE 제조 = 19
2.7.2. 한외여과막을 이용한 SED 분자량별 분획물의 제조, 분자량 및 활성 확인 = 19
2.7.3. 겔 여과 크로마토그래피를 통한 30 kDa 이상 분획물로부터 활성 물질 분리 = 20
2.7.4. 이온 교환 크로마토그래피를 통한 30 KD 이상 분획물로부터 활성 물질 분리 = 20
2.7.5. SDS-PAGE 겔 전기영동을 통한 활성 분획물로부터 단백질 분자량 확인 = 20
결과 및 고찰 = 22
3.1. 군소알 분말의 일반 성분 분석 = 22
3.2. SHE의 수율 = 22
3.3. 암세포 증식 억제율과 IC50 측정 = 22
3.4. SHE가 미치는 암세포핵의 형태학적 변화 유도 = 32
3.5. SHE 처리에 의한 암세포의 DNA 단편화 유도 = 33
3.6. Alkaline comet assay를 통한 SHE에 의한 암세포의 DNA 손상 유도 = 37
3.7. 유세포 분석을 통한 SHE에 의한 암세포내의 DNA 함량 변화 = 41
3.8. Western blot assay를 통한 SHE의 apoptosis 관련 단백질 발현 변화 = 46
3.9. SHE가 처리된 U-937과 FM3A 세포세포에서 Caspase-3 활성 측정 = 55
3.10. In vivo 상에서 SHE의 FM3A 세포로 유도한 종양 크기 억제 = 55
3.11. SHE와 분자량별 분획물의 고형물 함량과 단백질 함량 = 58
3.12. SHE와 분획물들의 단백질 분자량 확인 = 62
3.13. SHE와 분획물의 암세포 증식 억제 활성 유도 = 62
3.14. 겔 여과 크로마토그래피에 의한 물질 분리 = 65
3.15. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 물질 분리 = 68
3.16. 음이온 교환 크로마토그래를 통해 정제된 활성 분획물 내의 단백질 분자량에 따른 밴드 확인 = 68
결론 = 72
참고문헌 = 74
감사의 글 = 82
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김원석. (2008). 군소알로부터 항암 활성에 관한 연구
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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