까마중(Solanum nigrum L.)의 재분화조건 확립과 Cytochrome P450 유전자를 이용한 형질전환

Abstract

본 연구는 까마중(Solanum nigrum L.)을 cytochrome P450 유전자라고 추측되는 Arabidopsis CYP78A6 유전자로 형질전환하고, 생산된 형질전환체의 약용적 가치 및 환경이나 병해에 대한 반응, 제초제 저항성 및 유용물질의 생산 등에 관한 연구의 기초자료를 제공하고자 수행하였다. 까마중의 기관분화 조건은 잎과 줄기가 유사하여 캘러스는 0.5 ㎎/ℓ NAA, 신초유도는2.0 ㎎/ℓ BAP, 발근은 0.1 ㎎/ℓ IBA가 첨가된 MS 배지에서가 효율이 높았다. 그리고 이러한 조건을 통해서 줄기, 잎, 캘러스 각각을 이용하여 발근 개체를 얻을 수가 있었고 얻어진 발근개체들은 원예용상토가 들어있는 포트에서 순화시켜서 재분화 개체를 얻을 수가 있었다. 형질전환은 P450 유전자가 도입된 Agrobacterium tumefaciens GV3101 균주를 잎 절편에 접종한 후, 2.0 ㎎/ℓ BAP, 100 ㎎/ℓ kanamycin, 100 ㎎/ℓ carbenicillin이 처리된 MS 선발배지에서 신초분화를 유도하였다. 유도된 신초는 원예용상토가 들어있는 포트에서 순화시켰다. Agrobacterium을 접종하여 선발된 개체들은 "난쟁이형"과 "키다리형"의 2가지 표현형으로 나타났으며, 2가지 유형 모두 대조군에 비해 분화나 초기 성장이 2배 정도 느리게 나타났다. 유전자 삽입여부 확인을 위해 PCR 분석을 수행한 결과 NPTII 유전자는 모든 형질전환체에 삽입이 되었지만, Arabidopsis CYP78A6 유전자는 "키다리형" 1개체에는 삽입이 되지 않았다. 그러나 "키다리형" 개체들의 표현형이 서로 유사한 것으로 보아 Arabidopsis CYP78A6 유전자가 삽입된 2개의 "키다리형" 개체는 정상적인 발현은 이루어지지 않은 것으로 사료되고, "난쟁이형" 1개체는 Arabidopsis CYP78A6 유전자의 삽입과 발현이 모두 이루어진 것으로 사료되어진다. 앞으로 형질전환 개체를 좀 더 생장시킨 후에 RT-PCR 또는 RNA gel blotting 등의 방법을 통해 목적 유전자가 정상적으로 발현이 되고 있는지를 확인하고, 그 효용성에 대하여 연구를 수행하고자 한다.

This study was conducted in order to transform Solanum nigrum L. with Arabidopsis CYP78A6 gene presumed as a cytochrome P450 gene and to investigate on the responses to environmental damages and diseases, the resistance to herbicides, the production of useful substances, and the medical value from transformed plants. The regeneration conditions of the leaf and shoot segments of Solanum nigrum L. are similar each other: calli developed well on the MS medium with NAA 0.5 ㎎/ℓ, multiful shoots differentiated well on MS medium with BAP 2.0 ㎎/ℓ, and roots differentiated well on the MS medium with IBA 0.1 ㎎/ℓ from both of the leaf and shoot segments. Using these culture conditions, therefore, regenerated plantlets were obtained from the shoot and leaf segments, or calli, and subsequently the regenerated plantlets were acclimated on vermiculite in pot. For genetic transformation, leaf segments of Solanum nigrum L. were co-cultured with Agrobacterium GV3101 including Arabidopsis CYP78A6 genes and subsequently cultured on MS medium including BAP 2.0 ㎎/ℓ, kanamycin 100 ㎎/ℓ and carbenicillin 100 ㎎/ℓ to induce multiful shoots. Shoots isolated from multiful shoots were acclimated on vermiculite in pot. From this transformation experiment, 2 types of transformants, "the dwarf type" and "the tall type", were observed. Differentiation and initial growth rate of these transformants slowed down to 2 times as slow as those of the control plants. The PCR analysis was executed in order to confirm whether genes are inserted into Solanum nigrum L. or not. As results, NPTII genes which is a negative selective marker gene were transferred into all transformants while Arabidopsis CYP78A6 genes not into 1 transformant of "the tall type". However, morphological characteristics of all transformants of "the tall type" are similar each other regardless that Arabidopsis CYP78A6 genes were inserted or not. These results suggest that Arabidopsis CYP78A6 genes were inserted into and normally expressed in "the dwarf type" and that it did not normally expressed in 2 transformants of "the tall type" although successfully inserted. It needs to confirm whether Arabidopsis CYP78A6 genes are normally expressed or not through RNA gel blotting and RT-PCR and to study on the values of these transformants.