마늘(Allium sativum L.)의 원형질체 융합과 콜로니 형성

Abstract

Protoplasts were isolated from callus derived from the bulbils of garlic cultivars 'Namdo' and 'Jejujaerae', and were fused by polyethylene glycol (PEG) solution. When treated with the enzyme solution of 1% Macerozyme R-10 and 2% Cellulase R-10, callus induced from 'jejujaerae' yielded the highest number of protoplasts (1.8×10⁴protoplasts/mL). The number of protoplasts from 'Namdo' was highest (1.1×10⁴protoplasts/mL) when the callus was treated with an enzyme solution of 1~2% Macerozyme R-10, 1~2% Hemicellulase and 1~2% Cellulase-RS adjusted to pH 5.3. The optimal duration required for enzyme treatment to produce took 4 hours. The frequency of protoplast fusion was highest when treated with PEG solution having a molecular weight of 6,000 daltons at room temperature for 5 minutes and then cultivated for two hours in the dark. The fused protoplasts were cultured at 25℃ with 16 hours photoperiod in MS medium containing 0.1~1.0 mg/L 6-Benzylaminopurine(BA), 0.1~1.0 mg/L α-Naphthalene Acetic Acid (NAA) or their combinations. Colony was induced from fused protoplasts in 2 weeks and then cultivated in 1/2 MS containing 1.0 mg/L BA and 1.0 mg/L NAA. Colony formation is an important step leading regeneration of the plants.

남도마늘과 제주재래종 마늘 주아에서 유래된 캘러스를 이용하여 원형질체를 나출했고 PEG용액으로 융합했다. 원형질체 융합에 사용될 원형질체를 나출하기 위해서 효소의 조합을 1~2% Macerozyme R-10, 1~2% Hemicellulase 와 1~2% Cellulase-RS, 1~2% Cellulase R-10을 효소조합을 사용하였다. 효소혼합액내 mannitol과 sorbitol의 농도는 각각 0.3 M로 고정하였고, 1% DMSO와 2 mM DTT를 첨가했고, 또한 20 mM MES와 0.6 M mannitol의 농도를 고정한 방법에 5 mM MgCl₂와 1% DMSO를 첨가했다. 20 mM MES와 0.6 M mannitol의 농도를 고정하고 5 mM MgCl₂와 1% DMSO를 첨가했을 때, 제주재래종마늘 주아에서 유래된 캘러스는 1% Macerozyme R-10와 2% Cellulase R-10의 효소 조합에서 높은 수율을 나타냈고 (1.8×10⁴protoplasts/mL), 남도 마늘 또한 20 mM MES와 0.6 M mannitol의 농도를 고정하고 5 mM MgCl₂와 1% DMSO를 첨가했을 때, 1% Macerozyme R-10와 2% Cellulase R-10의 효소 조합에서 제주재래종마늘과 같이 1.1×10⁴protoplasts/ml로 높게 나타났다. 나출 시간은 남도마늘 5시간, 제주재래종마늘 4시간이 적당했다. 원형질체 융합은 PEG법을 사용했고, PEG 6000을 실온에서 5분간 방치하고 그 사이에 원형질체를 떨어뜨리고, 다시 5분 후에 섞어서 2시간 동안 암 조건에서 배양을 했다. 2시간이 지난 후에 기본 MS배지에 0.1~1.0 mg·L^(-1) BA, 0.1~1.0 mg·L^(-1) NAA를 첨가하고 25℃에서 16시간 광, 8시간 암 조건으로 배양했다. 2주간 배양한 후, 콜로니를 얻었고 캘러스 형성을 통한 재분화를 유도하기 위해 순원기 배양중에 있다.