불멸화 기법을 이용한 구제역바이러스 분리용 세포주 수립

Abstract

구제역은 그 전염성이 아주 강하고 급속히 전파되기 때문에 세계 각국에서는 구제역의 확산을 막기 위해 살처분정책을 사용하고 있다. 따라서 구제역은 발생에 따른 직접적 피해(폐사, 성장지연, 생산성 저하, 번식장애 등)와 더불어 살처분에 따른 축산업계의 경제적 피해가 아주 크다고 할 수 있다. 이와 더불어 육류소비의 저하와 관광산업의 위축 등 간접적 손실을 주고 사회적 혼란까지 야기할 수 있는 중요한 가축전염병이다. 구제역의 확산을 막기 위해서는 신속한 진단이 선행되어야 한다. 구제역 진단에 가장 효율적인 방법 중 하나는 감수성이 높은 세포에 검사재료를 접종하여 구제역바이러스를 검출하는 것이다. 현재 구제역바이러스 분리를 위해 돼지 친화계통바이러스는 돼지신장유래 세포주(IBRS-2), 소 및 기타 반추류 유래 바이러스는 햄스터세포주(BHK-21)나 소초대신장세포를 활용하고 있는데 햄스터세포주는 구제역바이러스에 대한 감수성이 떨어진다. 바이러스증식이 잘되는 소초대신장세포는 유효계대수가 짧아 바이러스의 진단에 오래 사용하기 어렵고 초저온 동결 후 해동 시 감수성이 떨어진다. 그러므로 구제역바이러스의 검출을 위해 필요할 때마다 새로운 초대배양세포를 빈번히 작성해야 하는데 초대세포작성에 필요한 신선한 소조직의 공급이 되어야한다는 문제점과 이로 인하여 진단이 신속하게 이루어지기 어렵다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결할 수 있는 방법으로 새로운 세포주의 작성이 시급하다. 하지만 새로운 세포주를 작성하기 위해서는 초대배양 및 불멸화를 위한 선행연구가 필수적으로 이루어져야 한다. 이를 위하여 소태아의 초대배양 방법의 정립과 초대배양 세포의 불멸화를 연구하였다. 조직을 구성하는 세포는 세포접착인자 등에 의해서 세포 상호간에 혹은 기질에 단단히 부착하고 있으므로 단일세포를 얻기 위해서는 이러한 결합을 단백질 분해효소를 사용하여 소화해야 한다. 단백질 분해 효소에는 trypsin, pronase, dispase, papain, pancreatin 등이 있는데 이러한 효소 중에 특히 collagenase는 collagen이 풍부한 종양조직, 간, 폐 등의 조직에서 단일세포를 얻기 위해 많이 사용하고 있는데 trypsin과는 달리 세포독성이 적고 3시간이 넘는 처리시간에도 세포가 상해를 입지 않는 것으로 알려져 많은 학자가 추천을 하고 있다. 또한 박테리아에서 분리한 collagenase와 dispase는 혈청에 의해서 단백분해 기능이 억제되지 않기 때문에 혈청을 포함한 배지에서 사용이 가능하므로 혈청을 포함한 배지에서 세포분리 작업을 하면 세포의 생존율을 많이 높일 수 있다(Stenn 등, 1989; Fujita 등, 1992; Brandsch 등, 1998). 하지만 상피세포를 분리하기 위하여 이런 효소를 사용할 때 처리시간과 용량을 정확하게 결정하지 못하면 상피세포뿐만 아니라 조직을 구성하고 있는 여러 종류의 세포들 특히 섬유아세포의 분리 및 혼입이 다량으로 이루어지므로 정확한 처리 농도와 시간이 중요하다 할 수 있다. 초대배양을 위하여 조직을 잘게 자르게 되면 조직의 모세혈관에 있던 다량의 RBC가 유출되는데 그대로 효소 처리를 하여서 배양을 하게 되면 상피세포가 배양 용기에 부착하는 것을 RBC가 방해하게 되어서 결과적으로 상피세포의 배양이 실패하게 되는 원인이 된다. 특히 혈액을 많이 포함하고 있는 신장이나 폐 같은 조직은 RBC의 제거가 무엇보다도 중요하다. RBC의 파괴를 유도함으로써 RBC 제거에 많이 사용되는 NH₄Cl/HEPES 용액을(Juy 등 1979; Stähli 등 1980) 본 실험에도 사용하여 보았다. 그 결과 RBC의 제거에는 효과가 좋았으나 상피세포 자체의 생존율에 좋지 않은 결과를 보여주었다. 반면에 배지를 첨가하여 절편된 조직을 부유시킨 후 일정시간 정치시킴으로 조직이 가라앉게 한 후 상층액을 제거하는 희석법은 RBC의 제거에 있어서 비슷한 효율을 보였으며 상피세포의 생존율을 높이는데도 훨씬 유리하다는 것을 알 수 있었다. 이는 절편된 조직에 배지를 첨가함으로써 pH와 삼투압의 안정적인 조절이 가능하고 영양분을 공급하여줌으로써 생존율이 올라간 것으로 판단이 된다. 또한 용액의 제조나 번거로운 처리과정이 없어서 조직의 처리 시간이 단축된 것도 한 원인이라고 생각된다. 조직에 효소를 처리하기 위한 최적의 조건은 Table 1에서 보는 바와 같이 장기의 종류에 따라서 시간과 농도가 약간씩 다른 것을 알 수 있다. 처리시간이 길어지면 섬유아세포의 급격한 혼입이 이루어지고 처리시간이 너무 짧으면 상피세포의 분리가 충분히 이루지지 않는다. 일반적으로 소장의 경우는 조직을 절편하지 않고 간(liver)의 효소처리 경우와 같이 내강에 주사기 등을 사용하여 단백질분해 효소를 채우는 방법을 많이 사용한다(Zhao와 Duncan, 2005; Mansuroglu 등, 2009). 하지만 대형동물의 소장이나 마우스의 간처럼 내강에 주사기 바늘을 삽입하기 용이한 경우에는 상관이 없으나 동물태아의 소장에 이용하는 경우는 1 ml 주사기와 바늘을 사용한다 하더라도 장기 자체가 아주 연약하고 내강 또한 협소하기 때문에 바늘의 삽입이 어려운 점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 소장조직을 일반 장기처럼 잘게 소분한 후 효소처리를 한 결과 내강에 효소를 충진 하였을 때 보다 상피세포가 많이 분리되는 결과를 얻었다. 이는 효소가 작용할 면적이 증가하여서 상대적으로 더 많은 상피세포의 분리가 이루어지도록 하였고, 효소 처리 후 피펫팅으로 인한 기계적인 세포의 유리가 가능하여서 결과적으로 분리되는 상피세포의 양이 늘었다고 판단이 된다. Mincing에 의한 효소처리의 조건을 잘 설정하면 섬유아세포가 같이 분리되는 것을 최소화 하여 장상피세포만을 선택적으로 분리하는 것이 가능하므로 내강에 효소를 충진 하는 수고를 덜 수 있었다. 초대배양된 세포는 각장기별로 성장특성이 달랐다. 상피세포의 분열속도가 빠른 신장과 소장의 경우 1차 계대배양 시 세포의 양이 많이 늘었지만 분열속도가 느린 뇌의 경우는 세포의 양이 많이 늘지 않은 것을 볼 수 있었다. 본 연구에서 제시한 효소의 처리 농도와 시간은 소분된 조직의 크기와 실험을 수행하는 연구자의 숙련도에 따라서 달라질 수 있다. 조직의 소분은 수술용 칼이나 안과용 가위 등으로 가능한 절단면을 매끈하게 하는 것이 중요하다. 둔탁한 기구를 사용하면 세포에 압력이 가해져서 세포를 상하게 할 수 있다. 본 연구결과를 바탕으로 다양한 동물의 태아와 장기에서 상피세포의 초대배양이 가능하다고 판단된다. 초대배양을 할 때 문제가 되는 섬유아세포를 Na₂EDDA와 농도가 낮은 FBS를 함유한 배지를 이용하여 효율적으로 제거하는 방법을 찾고자 하였다. 본 연구의 결과 Na₂EDDA를 시간별로 처리하면서 농도가 낮은 배지를 첨가하여 세포를 배양하면 90% 이상의 섬유아세포를 제거 할 수 있는 결과를 얻었다. Drewa 등(2006)이 발표한 논문에 따르면 Na₂EDDA는 세포간의 Ca2+결합 사이에 들어가서 섬유아세포의 결합을 효과적으로 저해 할 수 있다고 하였다. 배양 시에 세포가 서로 결합하는 많은 형식중의 하나인 anchorage결합에 의한 세포 간 결합(Yonemura 등, 1995)은 매우 강한데 이 결합은 상피세포가 섬유아세포보다 더욱 더 풍부하게 가지고 있다(Niederauer 등, 1994; Vasioukhin 등, 2000). 이로 인해 Na₂EDDA를 처리할 경우 상피세포가 섬유아세포보다 더욱더 오랜 시간 배양 용기에 붙어 있을 수 있게 한다. 또한 FBS의 농도에 따라서 세포간의 결합이 달라지는 것(Boisseau 등, 1992)을 이용하여 낮은 FBS의 농도에서 배양한 결과 효율적으로 세포를 분리할 수 있었다고 사료된다. 섬유아세포를 제거할 때 DMEM-10 배지로 세포를 배양한 후 세포단층이 24시간 후에 100% 이상이 되도록 하는 것이 상피세포가 섬유아세포와 함께 분리되는 비율을 낮출 수 있었다. 이는 세포들을 밀집하여 자라게 하면 상피세포들이 서로 결합하고 있는 힘이 강해져서 Na₂EDDA처리에 섬유아세포보다 효과적으로 저항을 할 수 있기 때문이라고 사료된다. 1차 처리를 하면 섬유아세포의 대부분이 제거되지만 상피세포와 접하고 있는 경계부근의 세포들은 박리가 이루어지지 않는다. 1차 처리 후에 6시간이 경과하여 2차 처리를 하면 상피세포와 섬유세포가 만나고 있는 경계 부근의 섬유아세포가 탈락되어 나오는 것을 볼 수 있었다. 2차 처리 시간이 12시간을 넘어가게 되면 상피세포와 접하고 있는 섬유아세포의 탈락은 일어나지 않았다. 2차 처리 후 12시간 이내에 3차 처리를 하게 되면 대부분의 상피세포가 섬유아세포와 함께 분리가 되는 현상이 발생한다. 3차 처리는 상피세포들 간의 세포연결은 충분히 회복되지만 섬유아세포의 세포들 간 연결이 느슨한 시기인 12시간~24시간 사이에 하는 것이 가장 유리하였다. 실험적 방법에 대한 제언을 하자면, Na₂EDDA처리를 할 때 섬유아세포의 분리가 이루어지기 시작하는 시간과 상피세포의 분리가 시작되는 시간의 차이가 30~50초로 매우 짧으므로 Na₂EDDA처리를 하면서 현미경으로 세포의 상태를 계속 살펴보아야 한다. Na₂EDDA처리 후 현미경을 통하여 계속 관찰하면 섬유아세포의 넓고 길쭉한 세포질이 수축하는 모습을 관찰 할 수 있는데, 섬유아세포가 완전히 수축하여 서로 뭉치게 되는 시점에 배양 용기를 살짝 흔들거나 손으로 쳐서 충격을 주면 쉽게 분리를 시킬 수 있다. 1차로 섬유아세포를 분리할 때 많은 양을 한꺼번에 제거하기 위하여 상피세포의 세포질이 수축하기 시작하고 나서도 계속하여 Na₂EDDA처리를 하면 어느 한 순간 상피세포의 대부분이 배양용기에서 분리가 되므로 상피세포의 세포질이 변화를 시작되면 FBS가 충분히 첨가된 배지를 이용하여 세척을 하여야 한다. 너무 강하게 세척을 하면 상피세포가 탈락하므로 세척 시에는 피펫에서 나오는 배지가 배양 용기에 바로 닿지 않도록 앞면이나 옆면의 벽면을 이용하여 흘려주어야 한다. Na₂EDDA를 이용하여 초대배양세포에서 섬유아세포를 제거하는 실험은 어느 정도 충분한 경험과 기술적인 노하우를 필요로 하는 것이 사실이다. 초대배양 시 계대수가 증가함에 따른 섬유아세포의 Na₂EDDA에 대한 저항성이 더 큰 인자로 작용하므로 효율적으로 섬유아세포를 제거하기 위해서는 적어도 8번 계대(약 15세대)하기 전에 Na₂EDDA 처리를 시행하여야 한다. 결론적으로 본 연구에서는 1차와 2차 그리고 3차에 걸쳐서 Na₂EDDA를 처리하는 조건을 제시하여 효율적으로 섬유아세포를 제거할 수 있는 방법을 제시하였다. 이는 기존 초대배양 시 가장 큰 문제 중 하나였던 섬유아세포의 우점현상을 해결 할 수 있는 실험방법으로 다양한 동물과 장기에서 사용이 가능할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 최종적으로 구제역바이러스에 대한 감수성이 유지되고 연속배양이 30대 이상 가능하여 신속한 바이러스의 검출에 숙주세포로 사용될 불멸화된 구제역바이러스에 감수성이 있는 소유래 세포주를 작성하고자 하였다. 제작된 세포주의 telomerase 발현양상조사, 세포모양 관찰, 세포배양 유효 계대수 측정, 염색체 검사, 마이코플라즈마등 잡균 감염검사와 바이러스 감염검사를 통하여 후보 세포주를 선정하고 선정된 후보 세포주에 대한 구제역바이러스 감수성 검사를 통하여 최종 후보주를 선택하였다. 제작된 세포주의 telomerase 발현양상을 Real-Time PCR을 통하여 조사한 결과 신장 Type-2 세포주와 신장 Type-3 세포주에서 높은 fluorescence 값이 나왔으며 25세대까지 지속적으로 telomerse가 발현되는 것을 볼 수 있었고, 세포 유효 계대수를 측정한 결과 25세대까지 비교적 일정한 분열속도를 보였으며 염색체의 큰 변화도 보이지 않았다. 실험동안 오염이나 소 태아 자체의 오염 여부를 알아보기 위한 잡균 감염 실험과 바이러스 감염 실험에서 제작된 세포주 모두 음성이 나왔다. 구제역바이러스에 감수성이 있을 것이라고 생각되는 유력한 세포주인 신장 Type-2 세포주와 신장 Type-3 세포주를 불멸화를 하지 않은 일반 세포와 일반적으로 구제역바이러스에 감수성이 있다고 알려진 IBRS-2 세포주를 각각 구제역바이러스의 감수성 검사결과 바이러스 접종 24시간 후 신장 Type-2 세포주와 Type-3 세포주 그리고 일반신장 세포에서 IBRS-2 세포주 보다 100~1000배 정도 높은 TCID50/ml를 보였다. 이는 제작된 신장 T2 세포주와 신장 T3 세포주가 불멸화가 되면서 일반세포가 가지고 있는 생물학적 특성을 그대로 유지하였음을 보여준다. 또한 제작된 세포주가 기존에 사용하던 IBRS-2 세포주에 비하여 100배 이상 더 높은 titer를 보임으로서 구제역바이러스의 조기 분리와 감수성 검사를 한층 더 발전시킬 것으로 예상되어진다. 제작된 세포주를 이용하면 구제역 발생 초기에 신속한 바이러스의 검출과 연구에 많은 도움이 될 것이라고 판단이 되고, 구제역 백신의 개발에 있어 중요한 요소 중 하나는 바이러스를 고역가로 생산할 수 있는 세포주의 확보라 할 수 있는데, 구축된 세포주는 이에 적합하고 또한 바이러스의 연속적 계대배양을 통하여 약독화 바이러스주를 생산하는데도 적합하여 백신개발에 필요한 숙주세포로 활용이 가능하리라 판단된다. 또한 암세포가 아닌 정상 상피세포의 특성을 간직하고 있는 제작된 세포주를 앞으로 더 다양한 소유래 바이러스의 감수성 검사를 거쳐서 바이러스 검출용 숙주 세포주 혹은 바이러스 생산용 세포주로 사용이 가능할 것이다.

Immortalized primary bovine epithelial cell lines which were sensitive to detect foot-and-mouth disease virus (FMDV) have been established by primary culturing of bovine fetal kidney, thyroid gland and laryngo-pharyngial tissues. Epithelial cells were separated after removing fibroblasts by Na2EDDA treatment because fibroblast were not susceptible for the detection of FMDV. Each cell lines have been tested for normality by chromosome analysis, culturing patterns, shape, microorganism contamination test, and propagation potency by checking population doubling time until 25 passages. T2 and T3 cell lines (kidney epithelial cells) were continuously grown without remarkable decreasing of growth rate and steadily expressed telomerase reverse transcriptase. T2 and T3 cell lines were about 100-times more sensitive to produce FMDV than IBRS-2 (control cell line) at 24 hours post infection. Conclusively, T2 and T3 cell lines have been proved as immortalized primary epithelial cells with normal features and high susceptibility for FMDV.