제주도 양식넙치에서 분리된 비브리오세균의 신속동정과 항생제 내성

Abstract

Vibrio속은 최근까지 전 세계적으로 약 65종이 분리되어 보고되고 있으며 계속적으로 증가하는 추세이다. Vibrio속 세균은 gram 음성 간균으로 해수, 기수 담수 지역에 널리 분포하는 상재 세균으로서 어류, 갑각류 및 연체동물에 이르는 다양한 수산 생물에 감염시킨다. Vibrio속의 동정은 형태학적, 혈청학적 방법 및 생화학적 방법, 유전학적 방법 등을 통해서 진행되고 있다. 이 연구에서는 유전학적 방법 중 aroA 유전자를 이용하여 Vibrio속을 동정하였다. aroA 유전자는 5-enolphyruvylshikimate-3-phosphate synthase를 인코딩하는 유전자로 박테리아의 성장에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 연구는 aroA 유전자를 이용하여 Vibrio속의 분자계통분류학적 관계성 및 다양성을 조사하였으며 이를 토대로 Vibrio속의 신속한 동정을 위한 방법을 구축하여 제주도의 양식 넙치에서 발생하는 세균성 질병의 원인균인 Vibrio속 동정하였다. aroA 유전자를 이용한 Vibrio속 표준균주의 계통분석과 질병에 감염된 양식 넙치에서 분리된 비브리오의 aroA 유전자 cloning을 통해 얻어진 데이터를 이용하여 어병 원인 비브리오의 특이 서열로 detection primer가 제작되었다. 제작된 detection primer로 Multiplex PCR을 통해 넙치에서 분리된 비브리오를 동정하였다. Detection 결과 Vibrio scophthalmi가 45.3%, Vibrio harveyi가 24.0%, Vibrio anguillarum이 0.9%, Vibrio pelagius가 3.8%, Vibrio pomeroyi가 6.4%를 나타내었다. 또한 양식 넙치에서 분리되는 비브리오 중 동정된 비브리오 중 주로 분리되는 비브리오를 선택하여 18 종류의 항생제를 이용하여 감수성 시험을 수행하였다. 항생제 감수성 시험 결과, 검출된 Vibrio scophthalmi, Vibrio harveyi, Vibrio pelagius, Vibrio pomeroyi는 상대적으로 clindamycin에 대해 높은 내성을 보였고, cholramphenicol, florfenicol, norfloxacin, ofloxacin, oxolinic acid에 대해서 많은 균주들이 감수성을 보였다. 그리고 amoxycillin과 ampicillin에 대해 Vibrio pelagius 만이 높은 감수성을 나타내었으며 나머지 Vibrio scophthalmi, Vibrio harveyi, Vibrio pomeroyi는 높은 내성을 보였다. 감수성 시험 결과 종에 따라 18개의 항생제에 대해 내성정도의 차이를 보였으며, 종 사이에서도 다소의 항생제 내성 정도의 차이를 보였다. 따라서, aroA 유전자를 이용한 세균성 질병 원인균의 신속 동정과 항생제 감수성 시험을 통하여 신속하고 적절한 치료 대책의 마련함으로써 제주도 양식장에 큰 피해를 주고 있는 비브리오증을 포함한 세균성 질병을 극복할 수 있을 것으로 생각 된다.

The genus Vibrio comprises about 65 recognized gram-negative species which are widely distributed in estuarine and marine environments. As some Vibrio species have long been known as bacterial pathogens to marine organisms and human beings, many researchers have attempted to develop the method for rapid and accurate identification. Taditionally, they have been identified based on morphological, serological and biochemical methods. In recent years, rDNA sequences have been adopted for bacterial taxonomy including Vibrio to overcome the shortage of traditional methods. However, there are still some problems in identification of closely related bacterial species due to the conservation of rDNA sequences. Thus, we tried to develop the more rapid and accurate identification method than before by using the DNA sequences of aroA gene and multiplex PCR. The aroA gene encodes 5-enolphyluvyshikimate-3-phospate synthase which is a key enzyme in the aromatic amino acid biosynthetic pathway in microorganism. Vibrio species were isolated from the diseased olive flounders sampled at the hatcheries in Jeju island and standard strains of Vibrio were purchased from CECT, KCCM and KCTC. aroA genes of Vibrio were then cloned and sequenced for detection primer design and phylogenetic analysis. By using detection primers designed based on multiple alignment and phylogenetic analysis, multiplex colony PCRs have been performed for the simultaneous detection of major Vibrio spp. isolated from the farmed olive flounder, Paralichthys olivaceus, in Jeju Island. As a result, four major Vibrio species among total number of isolated strains were Vibrio scophthalmi (45.3%), Vibrio harveyi (24.0%), Vibrio pomeroyi (6.4%), Vibrio pelagius (3.8%) and Vibrio anguillarum (0.9%). Antimicrobial susceptibility, resistant pattern and combined action to the 18 antibiotics were tested with the identified Vibrio species in order to treat the vibriosis effectively and rapidly. High degree of antimicrobial resistance to clindamycin was detected in all four species tested including Vibrio scopththalmi, Vibrio harveyi, Vibrio pelagius and Vibrio pomeroyi, whereas these species were highly sensitive to chloramphenicol, florfenicol, norfloxacin, ofloxacin and oxolinic acid. However, we found that the degree of antimicrobial susceptibility was various even between strains of the identical Vibrio sp.