제주연안에서 분리된 해양유래 방선균의 다양성 및 미생물 2차대사산물의 생리활성 탐색

Abstract

본 연구에서 시료를 채집한 제주도 해안의 특성은 대부분 용암류가 바다에 접하면서 형성된 전형적인 화산해안이다. 제주도의 지질분포를 보면 화산암이 전체 면적의 95％ 이상을 차지하며, 서귀포 일대를 제외하면 해안에는 주로 현무암이 분포하고 있다. 비록 해안선이 단순하지만 해안에 다양한 형태의 기질이 존재하고 있으며, 열대와 아열대 생물인자를 온대해역으로 수송하는 쿠로시오의 지류인 대마난류의 영향권에 위치함에 따라 한반도의 해안과는 다른 종 조성을 가지고 있다. 이런 점에서 우리나라 해안 생태계에서 제주도 해안생태계가 가지는 중요성이 입증되고 있으며 온대와 아열대 및 열대 생물이 공존하는 곳으로서 특이한 생물 지리적 특성을 가지고 있다. 또한, 제주도 해안가는 암반 조간대가 대부분을 차지하고 있기 때문에 조수웅덩이가 주기적으로 생성될 수 있는 조건을 갖추고 있으며, 크기 또한 다양하여 주변의 해양환경과 육상 환경 조건에 따라 독특한 생태적 특성을 보이고 있다. 이러한 제주도의 해안 생태계의 중요성과 특이성 때문에 상대적으로 많은 연구진들이 제주도 해양생물 조사를 시도하였다. 본 연구에서는 제주도 해안을 중심으로 해양에 서식하는 생물, 해조류 및 해수와 모래를 채집하여 그로부터 분리되어지는 해양유래 방선균의 다양성을 연구하였다. 연구를 수행하기 위해 시료를 채집한 지역은 제주도 해안가를 중심으로 제주시 지역과 서귀포시 지역으로 나누어 제주시 지역은 동부와 서부지역으로 서귀포시 지역 또한 서부 지역과 동부 지역으로 구분하여 각 지역 마다 형성된 암반 조간대에서 시료를 채집 하여 미생물을 분리하였다. 해양유래 방선균을 분리하기 위해 생물 시료를 채집한 지역의 환경요인을 조사해 본 결과 수온, 염분농도, 용존산소, 화학적 산소요구량, 영양염류는 평균값과 큰 차이를 나타내지 않았으며 해수의 pH는 약 알카리성을 나타내었다. 채취된 시료로부터 해양유래 방선균주를 분리하였으며, 분리균의 생화학적 특성 및 16S rRNA 분석을 통하여 분리균의 계통학적 분석을 한 결과 제주도 해안 4개 지점 9개 지역에서 분리된 해양유래 방선균은 총 145균주를 분리하였는데 그 중 색소를 형성하는 방선균은 101 균주를 분리하였다. 해양에서 분리 되어진 대부분의 방선균주들은 성장 온도 범위는 4 ℃～40 ℃까지 범위에서 성장이 가능하였으며, 10~35℃ 범위에서 좋은 성장을 보였다. 염 농도 실험에서는 다양한 염분 농도에서도 성장이 가능하였다. 최저 0 ％에서 최대 12.0 ％의 염 농도에서도 성장이 가능한 광염성 미생물(11종)과 초기 생육 배지내에 염분이 있어야만 성장이 가능한 호염성 미생물(48종)이 존재하였다. 이러한 염분농도에 대한 성장실험결과는 방선균이 육상에서 해양으로 유입이 되어서 적응을 하면서 생존을 한 종들과 그러한 종들이 오랜 시간 진화를 거듭하면서 해양미생물로서의 양상을 보여주는 중요한 증거 자료가 된다. 분리되어진 방선균 배양액 색상은 yellow, red, orange, brown, green, pink, violet 등으로 육상 방선균주 배양액들과 비교해 보았을 때 매우 다양한 색소를 생산했으며 대체적으로 aerial mycelium의 creamy, white, gray, yellow, green 계열의 색상을 나타냈다. 분리된 101균주의 색소를 추출한 뒤 carotenoid 또는 bacteiochlorophyll의 유무를 확인한 결과 83균주가 carotenoid의 흡광도 측정 범위인 350～540 nm에서 peak를 나타내었다. 반면 bacteriochlorophyll에 상응하는 파장범위에서는 흡광도 peak를 나타내는 균은 없었다. 제주도 제주시 동부지역(Group Ⅰ, Site A, B) 해양에서 분리된 방선균 24균주는 Gram positive bacteria(divission)／ Actinobacteria(class)／ Actinomycetales(order)／ Streptomycineae(suborder)／ Streptomycataceae(family)／ Streptomyces(genus)에 22 균주, Actinomycetales(order)／ Streptosporangineae(suborder)／ Nocardiopsaceae(family)／ Nocardiopsis(genus)에 2 균주가 분리되었으며, 분리균주 염기서열을 type strain과 비교한 결과 제주시 동부지역에서는 Streptomyces 속 균주 10종(species), Nocardiopsis 속 균주 2 종을 확인하였다. 제주시 서부지역 (Group Ⅱ, Site C, D) 해양에서 분리된 방선균 28균주는 Gram positive bacteria(divission)／Actinobacteria(class)／Actinomycetales(order)／ Streptomycineae(suborder)／Streptomycataceae(family)／Streptomyces(genus)에 27 균주, Actinomycetales(order)／ Streptosporangineae(suborder)／ Nocardiopsaceae(family)／ Nocardiopsis(genus)에 1 균주가 분리되었으며, 최종적으로 Streptomyces 속 균주 17종(species), Nocardiopsis 속 균주 1 종을 확인하였다. 제주도 서귀포 동부지역 (Group Ⅲ, Site E, F, G) 해양에서 분리된 방선균 총 58균주로서 가장 높은 방선균 분리율을 나타낸 지역이다. 분리된 해양 방선균들은 Gram positive bacteria(divission)／Actinobacteria(class)／Actinomycetales(order)／ Streptomycineae (suborder)／Streptomycataceae(family)／Streptomyces(genus)에 51 균주, Actinomycetales(order)／Streptosporangineae(suborder)／Nocardiopsaceae (family)／ Nocardiopsis(genus)에 7 균주가 분리되었으며, Group Ⅲ에서는 Streptomyces 속 24종(51균주 중), Nocardiopsis 속 4종을 분리하였다. 서귀포 서부지역 (Group Ⅳ, Site H, I)해양에서 분리된 방선균 35 균주는 모두 Gram positive bacteria(divission)／Actinobacteria(class)／Actinomycetales(order)／ Streptomycineae(suborder)／Streptomycataceae(family)／Streptomyces(genus)에 분류학적으로 포함되었으며, Site H, I (Group Ⅳ)에서는 Streptomyces 속 균주 18종(species)을 확인하였다. 제주도 해안 4개 지역 9개 지점에서 분리되어진 145개의 해양 방선균 대부분의 미생물은 Gram positive bacteria／ Actinobacteria ／ Actinomycetales(order)그룹(100％)에 속하였으며 다음으로 Streptomycineae(suborder)／ Streptomycetaceae(family)／ Streptomyces(genus) 그룹(93.1％), Streptospotangineae(suborder)／ Nocardiopsaceae(family)／ Nocardiopsis(genus)(6.9％)로 나타났다. 최종적으로 해양에서 분리된 방선균주 145 균주 중 유전적 유사도(similarity)가 가까워 동일한 종일 가능성이 높은 균주를 제외하고 Site A~Site I까지 총 55 종 (Species)이 조사되었으며, 55종 중 Streptomyces (genus)에 51종이 속하였으며, Nocardiopsis (genus)에 4종이 포함되었다. 본 연구에서 제주도 해양에서 분리 되어진 방선균 및 미생물의 16S rRNA 염기서열을 분석하여 본 결과 총 11균주(방선균주 4종, 해양미생물 7종)가 새로운 종일 가능성이 매우 높게 나타났다. 이들에 대해서는 앞으로 근연속의 근연종 즉 type strain을 분양받아 미생물의 배양 특성, 형태적 특성, 생리·생화학적 특성, 화학적 특성, 분자생물학적 특성을 비교 분석할 필요가 절실히 요구된다. 신종 후보 균주 JJM10^(T)은 제주도 애월 해수욕장의 해양무척추동물인 Siphonaria sirius (Mollusca: Basommatophora)로부터 분리되어졌으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 비교해본 결과 Gammaproteobacteria의 Glaciecola nitratireducens KCTC 12276^(T)과 Glaciecola pallidula LMG 21427^(T)(96.1 and 95.43 ％ 16S rRNA gene sequence similarity)와 가장 유사하였다. 분리균주는 그람 음성, 호기성 및 약 호염성 세균으로서 염 농도 1~10％ 및 배양온도 10~37℃에서 성장한다. Citrate 및 phenylacetate을 이용하지 않으며, produces cytochrome oxidase를 생산하는 특성을 가지고 있다. 그러나 Ornithine decarboxylase, lysine decarboxylase, urease 및 H2S 생산하지 않았다. Inositol, sorbitol, rhamnose, melibiose 및 amygdalin 발효실험에서 양성을 나타냈다. 최종적으로 신종후보 균주 JJM10^(T)은 Glaciecola nitratireducens KCTC 12276^(T) 및 Glaciecola pallidula LMG 21427^(T)와 가장 유사한 생리 및 생화학적 특성을 보였다. 분리균주 JJM10^(T)의 G+C 함량은 49.81 mol％로 나타났으며, 주요 세포지방산은 C_(16:0), Summed feature 4 (C_(16:1) w7c and／or iso-C_(15:0) 2-OH) 및 Summed feature 7 (C_(18:1)w9c／w12t／w7c)로 분석되었다. DNA-DNA 근연관계 데이터를 바탕으로 JJM10^(T)은 G. nitratireducens과 G. pallidula 종에서 분리되어졌다는 것을 확인할 수 있었다. 신종후보 균주 JJM57^(T)은 제주도 신촌 해안가의 해양식물인 Laurencia sp., 로부터 분리되어졌으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 비교해본 결과 Gammaproteobacteria의 Oceanisphaera litoralis DSM 15406^(T) 및 Oceanisphaera donghaensis KCTC 12522T(98.02 and 97.70 ％ 16S rRNA gene sequence similarity)와 가장 유사하였다. 균주는 Gram 음성, Oxidase 및 Catalase 양성의 완벽한 구형 형태로 6 ㎛의 큰 세포로 운동성을 가지고 있다. 중호염성 세균으로서 염 농도 1.0~11％, 배양온도 4~37℃, 성장에 있어서 Na^(+)를 필요로 하였다. Malate와 Citrate를 이용하였으며 arginine dihydrolase와 gelatin은 음성반응을 glycerol, succinate, L-valine 및 L-tyrosine은 양성반응을 보였다. galactose, glucose, arabinose, mannose, N-acetylglucosamine, maltose, gluconate, adipate 및 sucrose를 이용하여 산을 생성하지 않았으며, G+C 함량은 61.94 mol％로 나타났으며, 균주의 주요 지방산 분석 결과 C_(16:0), C_(18:1) w7c and Summed feature 3 (C_(15:0) iso 2-OH／C_(17:0) iso 3-OH／C_(16:1) ω7c.)로 나타났다. 균주의 형태학적, 생리, 생화학적 및 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석해본 결과 최종적으로 균주 JJM57^(T)는 신종일 가능성이 높아 Oceanisphaera laurenciae sp. nov.라고 명명하였다. 해양에서 분리된 방선균주 총 145종을 가지고 1차적인 항균 및 항산화 실험을 거쳐서 생리활성이 우수한 균주 21종(ACT 1~21)을 분리하였다. 분리된 균주 배양액의 메탄올 추출물을 이용하여 어류 및 인체질병유발 세균 10종을 이용하여 항균실험을 실시하였으며, ESR spectrometer를 이용하여 DPPH 라디컬 소거활성을 측정한 후, 항산화 활성을 평가하였다. 그 결과 최종적으로 균주 ACT-1, ACT-11, ACT-18 균주를 선정할 수 있었으며, 균주 동정 결과 ACT-1, ACT-18은 Streptomyces 종(Species)들과 가장 유사한 특성을 보였으며, 최종적으로 Streptomyces sp. ACT-1 및 Streptomyces sp. ACT-18이라고 각각 명명하였다. 그리고 균주 ACT-18은 Nocardiopsis dassonvillei 종과 가장 유사한 생화학적 및 유전학적 특성을 보여 Nocardiopsis sp. ACT-18이라고 명명하였다. 분리균주 ACT-1, ACT-18 및 ACT-18의 배양학적 특성을 확인한 결과 배양온도는 25℃~30℃, pH 범위는 6.8~8.4, NaCl 2~5％ 첨가구에서 가장 좋은 생육도 및 항산화활성을 보였다. 그리고 균주 Streptomyces sp. ACT-1의 최적배양조건을 확인한 결과 탄소원으로 Maltose (1％), 질소원은 Yeast extract (0.5％)로 나타났으며, 균주 Nocardiopsis sp. ACT-11은 탄소원으로 Galactose (1％), 질소원으로는 Yeast extract (0.5％), Streptomyces sp. ACT-18은 탄소원으로는 Mannitol(1％), 질소원으로는 Yeast extract (0.5％) 첨가 실험구에서 가장 높은 생육도 및 항산화활성을 보였다. 균주의 생육 및 생리활성물질 생산을 위한 최적배양조건을 확인한 후, 배양 추출물의 생리활성을 평가하였다. 생리활성 평가를 위해 균주 배양액 메탄올 추출물을 제조하였으며, 항균 및 항산화 활성을 확인하였다. 그 결과 연쇄구균증 원인균인 Streptococcus parauberis (>100 ㎍／㎖), Streptococcus iniae(>100 ㎍／㎖)에 대하여 농도 의존적으로 매우 높은 항균활성을 확인하였으며, 활주세균증 유발 유사 세균인 Exiguobacterium oridotokrans (Wild Type)에 매우 높은 항균 감수성(>100 ㎍／㎖)을 보였다. 그러나 비브리오증을 유발시키는 균들에 대한 감수성은 거의 관찰되지 않았으며, 에드워드병 유발세균인 Edwardsiella tarda에 대해서는 높은 농도(>500 ㎍／㎖)였을 때 약간의 감수성이 관찰되었지만 낮은 농도에서는 거의 감수성이 없는 것으로 확인되었다. 분리균주 배양액 메탄올 추출물의 농도별 항산화 활성을 측정한 결과 SBME-1 100 ㎍／㎖농도 실험구에서는 46％, 500 ㎍／㎖에서는 53％ 1,000 ㎍／㎖에서는 67％의 DPPH 라디컬 소거 활성 (RSA)을 관찰할 수 있었다. NBME-11 실험구에서도 유의적인 차이는 없었지만 SBME-18 실험구에서는 가장 높은 74％의 라디컬 소거활성(>1,000 ㎍／㎖)을 보였다. Hydroxyl 라디컬 소거활성 결과 SBME-1(100 ㎍／㎖)과 NBME-11(100 ㎍／㎖) 투여 실험구에서는 각각 46％, 38％의 낮은 항산화활성을 보인 반면 500 ㎍／㎖ 농도 이상의 실험구에서는 SBME-1에서는 84％, SBME-18 처리구에서는 81％의 높은 항산화활성을 확인할 수 있었다. Alkyl 라디컬 소거활성 측정 결과 모든 실험구에서 농도 의존적으로 항산화활성이 증가하는 양상을 보이고 있었으며, 100 ㎍／㎖ 투여 실험구에서는 낮은 라디컬 소거활성(30~40％)을 보였다. 1,000 ㎍／㎖ 처리구에서는 SBME-18 추출물에서 가장 높은 74％의 라디컬 소거활성을 보였다. 또한 분리균주의 유기용매 분획물의 항균 및 항산화활성을 측정하였으며, 그 결과 균주 Streptomyces sp. ACT-1의 분획물의 항균 활성은 극성인 물을 용매로한 실험구들의 경우 항균활성이 미비한 결과를 보였으나 Chloroform, n-Hexan의 용매에서는 항균활성을 보이고 있었다. Hexane과 Chloroform 분획물에서는 연쇄구균증을 유발 세균에 대한 항균활성이 뚜렷하게 나타났으며, 비브리오증유발 세균들에게 전체적으로 약한 활성을 확인하였다. Streptomyces sp. ACT-18 분획물별 항균활성 측정 결과 Chloroform용매에서는 대부분의 병원성 균주에 대하여 강한 항균활성을 보였으며, n-Hexan 분획에서는 S. iniae, S. parauberis에 대하여 강한 활성을 보인 반면 비브리오에는 약한 활성을 보였으며, Wild type 활주세균에 대한 감수성은 관찰되지 않았다. 항산화활성 결과 Streptomyces sp. ACT-1 Chloroform 분획에서 가장 높은 DPPH 라디컬 소거활성 (RSA)을 보였으며, 1 ㎎／㎖의 농도였을 때 89％의 매우 높은 라디컬 소거활성을 확인할 수 있었다. 분리균주 Streptomyces sp. ACT-18 분획물 농도별 DPPH 라디컬 소거활성은 Chlroloform 분획에서 가장 높은 라디컬 소거활성을 보였다. Hydroxyl 라디컬 소거활성 결과 Streptomyces sp. ACT-1 n-Butanol 분획에서 가장 높은 라디컬 소거활성을 확인할 수 있었으며, Streptomyces sp. ACT-18 Hexane 분획에서는 58, 69, 74％의 라디컬 소거활성을 보였다. Alkyl 라디컬 소거활성 결과 Streptomyces sp. ACT-1 Ethyl acetate 분획에서 가장 높 라디컬 소거활성을 보였으며, 0.5 ㎎／㎖ 농도구에서는 66％의 소거활성을 보였다. Streptomyces sp. ACT-18 분획물 농도별 Alkyl 라디컬 소거활성은 Hexane 분획에서 Alkyl 라디컬 소거활성이 가장 높았으며, 0.1, 0.5, 1 ㎎／㎖에서 각각 35.4, 60, 76.1％로 나타났다. 해양방선균주 Streptomyces sp. ACT-1, Streptomyces sp. ACT-18 추출물을 이용한 양식어류 생물접촉 실험을 실시하였다. 그 결과 넙치의 성장도는 방선균 추출물이 첨가되지 않은 대조구 (Control)에서는 사육기간 동안 중증량이 154.4 g으로 나타났으며, 사료첨가제가 투여된 실험구에서는 SBME-18(Streptomyces Broth Methanol Extract ACT-18) 1％ 첨가구에서 가장 높은 174.3 g으로 확인되었다. 방선균 배양 추출물 첨가 사료 투여가 넙치의 생리 상태에 미치는 영향을 조사하기 위해 Glutamic oxalacetic transaminase (GOT), Glutamic pyruvic transaminase (GPT), Total protein, Glucose, Phosphorus, Triglycerides, Hemoglobin의 변화를 지표로 하여 조사하였다. 본 연구결과 혈청내의 GOT를 비교해 본 결과 첨가물을 투여한 실험구에서 약간 낮은 효소를 존재를 확인할 수 있었으며, 대조구와 비교해 본 결과 크게 유의적 차이는 보이지 않았으며, GPT 효소 또한 유의적 차이는 없는 것으로 확인이 되어 사료첨가제의 장기손상 여부는 거의 없는 것으로 확인이 되었다. 대조구에서 Glucose 농도가 증가하는 양상을 보였으며, 사료첨가제 투여 실험구에서는 Glucose 농도가 낮아지는 결과를 나타냈으며, Total protein, TG(Triglyceride), Phosphorus는 유의적 차이가 없었다. Hemoglobin 수치는 사료첨가제 투여구에서 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 또한 LDH 효소 분비를 측정하였지만 모든 실험구에서 유의적 차이를 확인 할 수는 없었다 (Not shown data). 어류식세포의 활성산소 측정결과 방선균 배양 추출물 첨가 사료를 투여한 모든 실험구에서 일반 사료를 투여한 대조구보다 높은 식세포활성을 확인 할 수 있었으며, 유산균주 2％ 투여한 실험구보다 매우 높은 식세포 활성을 확인 할 수 있었으며, Lysozyme은 Streptomyces sp. ACT-1 배양액 추출물 2w％ 첨가구에서 매우 높은 라이소자임 활성을 확인 할 수 있었다. 방선균 배양 추출물 첨가사료를 13주 동안 투여한 질병이 없는 건강한 넙치에 어류 병원성 세균인 Streptococcus iniae를 인위 감염 시킨 후, 15일 동안에 누적 폐사율을 조사하였다. 그 결과 일반사료를 투여한 실험구에서는 인위감염 3일째부터 폐사가 일어났으며, 지속적으로 증가하다가 10일째 80％의 폐사율을 보였다. ACT-1 2％첨가 실험구에서 60％의 폐사율을 보여 20％정도의 감소량을 확인할 수 있었으며, 전체적으로 5~20％의 폐사율 감소를 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해서 제주도내 해양방선균의 다양한 분포의 확인, 해양미생물의 생리학적 특성 및 신종 후보균주들을 분리, 분리된 해양미생물의 생리활성을 확인하였으며, 좋은 결과를 얻을 수 있었으며,차후 생리활성물질의 분리, 정제를 통한 물질의 동정 과정이 필요하며, 확보된 미생물 균주들의 응용방안에 대한 연구를 수행할 예정에 있다.

A total 145 strains of marine actinomycetes were isolated from marine sources in Jeju island. They were characterized by determining morphological and physio-biochemical properties, the API kit. They were investigated by molecular methods including partial sequencing of 16S rRNA. The phylogenic relationship of the domain bacteria was investigated by performing a comparative sequence analysis of PCR-amplified 16S ribosomal RNAs in organism of intertidal zone, Jeju island. Cultivated microorganisms isolated from marine organism sample and investigated analysis of 16S rRNA sequence. The 16S rRNAs were amplified by using oligonucleotide primer (27F-1492R) complementary to 16S rRNA genes. Phylogenetic diversity and taxonomic position of the isolated marine actinomycetes. Isolated 145 strains of marine actinomtcetes, since they grew in the various range of NaCl, pH and temperature. A neighbor-joining tree of partial 16S rRNA sequences divided the 145 isolates into 2 major groups, gram positive bacteria／ Actinobacteria ／ Actinomycetales(order)／ Streptomycineae (suborder)／ Streptomycetaceae(family)／ Streptomyces(93.1％),Streptospotangineae(suborder)／ Nocardiopsaceae(family)／Nocardiopsis(6.9％). Additionally, 11 candidates of new species were suggested based on the similarity of the 16S rRNA sequences to the previously published species. A taxonomic study was carried out on an isolated, stain JJM10^(T), from marine invertebrate Siphonaria sirius (Mollusca: Basommatophora) collected from the Aewol, Jeju island, Republic of Korea. Comparative 16S rRNA gene sequence studies showed that strain belonged to the Gammaproteobacteria and was most closely related to Glaciecola nitratireducens KCTC 12276^(T) and Glaciecola pallidula LMG 21427^(T)(96.1 and 95.43％ 16S rRNA gene sequence similarity, respectively). The isolated was Gram-negative, aerobic - VIII - and slightly halophilic and grew in 1~10％ NaCl and at 10~37℃. Does not utilize citrate, phenylacetate. produces cytochrome oxidase, but not ornithine decarboxylase, lysine decarboxylase, urease or H2S. Positive in tests for the fermentation of inositol, sorbitol, rhamnose, melibiose and amygdalin. Strain JJM10^(T) shared some physiological and biochemical properties with Glaciecola nitratireducens KCTC 12276^(T) and Glaciecola pallidula LMG 21427^(T). The G+C content of the genomic DNA of strain JJM10^(T) was mol 49.81％. Strain JJM10^(T) possessed C_(16:0), summed feature 4 (C16:1 w7c and／or iso-C_(15:0) 2-OH) and summed feature 7 (C_(18:1)w9c／w12t／w7c) as the major cellular fatty acids. DNA-DNA relatedness data indicated that strain JJM10^(T) represents a distinct species that is separate from G. nitratireducens and G. pallidula. On the basis of morphological, physiological and chemotaxonomic characteristics, together with data from 16S rRNA gene sequence comparisons described above, strain JJM10^(T)(=KCTC 22368^(T)) represent a novel species, for which the name Glaciecola siphonariae sp. nov. is proposed. Strain JMM57T was isolated from of a specimen of the marine plant Laurencia sp., collected from intertidal zone in the Jeju island, Republic of Korea. Comparative 16S rRNA gene sequence studies showed that strain belonged to the Gammaproteobacteria and was most closely related to Oceanisphaera litoralis DSM 15406^(T) and Oceanisphaera donghaensis KCTC 12522T(98.02 and 97.70 ％ 16S rRNA gene sequence similarity, respectively). Cells are gram-negative, oxidase-positive, catalase-positive. They occur singly and are 1.0~1.2 ㎛ in diameter. Contains a single polar flagellum. moderately halophilic and grows in 1.0~11％ NaCl at 4~37℃. The type strain, JJM57^(T), requires Na^(+) for growth, reduces nitrate, utilizes malate and citrate and is negative for arginine dihydrolase, gelatin and utilization of glycerol, succinate, L-valine and L-tyrosine. No acid is produced from galactose, glucose, arabinose, mannose, N-acetylglucosamine, maltose, gluconate, adipate or sucrose. The G+C content of the genomic DNA of strain JJM57^(T) - IX - was mol 61.94％. Strain JJM10^(T) possessed C_(16:0), C_(18:1) w7c and summed feature 3 (C_(15:0) iso 2-OH／C_(17:0) iso 3-OH／C_(16:1) 7c.) ω as the major cellular fatty acids. On the basis of morphological, physiological and chemotaxonomic characteristics, together with data from 16S rRNA gene sequence comparisons described above, strain JJM57^(T) represent a novel species, for which the name Oceanisphaera laurenciae sp. nov. is proposed. We went through primary antimicrobial and antioxidation experiment with 145 kinds of actinomycetes strains isolated from sea sources, and then isolated 21 (ACT 1~21) of bacterial strains. With methanol extraction from culture liquid of isolated bacterial strain, antimicrobial experiment was performed against 10 bacterials causing diseases for fishes and human beings. And after measuring DPPH radical scavenging activities using ESR spectrometer and then evaluated activation of antioxidation. As the result, finally, strains of ACT-1, ACT-11, ACT-18 are able to be selected, and behaviors of ACT-1, ACT-18 were found be most similar to Streptomyces species, Finally they were named Streptomyces sp. ACT-1 and Streptomyces sp. ACT-18. And strain ACT-18 has shown most similar biochemical and genetic characteristics to Nocardiopsis dassonvillei, therefore, it was named Nocardiopsis sp. ACT-18. Isolated strains ACT-1, ACT-18 and ACT-18 was verified for cultivating characteristics, they showed the best growth and antioxidation under temperature of 25℃~30℃, pH of 6.8~8.4 and NaCl of 2~5％. And after checking the best cultivating condition for strain of Streptomyces sp. ACT-1. it showed Maltose(1％) for carbon source and Yeast extract(0.5％) for nitrogen source, and strain of Nocardiopsis sp. ACT-11 showed Galactose(1％) for carbon source and Yeast extract(0.5％) for nitrogen source. And Streptomyces sp. ACT-18 showed Mannitol(1％) for carbon source and Yeast extract for nitrogen source indicating that it has the highest growth and antioxidation activation with addition of experimental bacillus. - X - After checking optimized cultivating condition for growing bacterial strain and producing physiological activation substance, and physiological activation for extraction of cultivated substance was evaluated. Methanol extraction in bacterial strain culture liquid was produced for evaluating physiological activation and antimicrobial and antioxidation activation are verified. As the result, methanol extraction from culture liquid of Streptomyces sp. ACT-1 was verified to be very high antimicrobial activation depending on density with Streptococcus parauberis (>100 ㎍／㎖), Streptococcus iniae (>100 ㎍／㎖). And it showed very high antimicrobial sensitivity (>100 ㎍／㎖) against Exiguobacterium oridotokrans(Wild Type). However, sensitivity for bacterials causing vibriosis showed almost nothing and Edwardsiella tarda causing showed a little bit of sensitivity for a little higher density of Edwardsiella tarda (>500 ㎍／㎖) but it showed rarely sensitivity at low density. Methanol extraction of Nocardiopsis sp. ACT-11 had almost no sensitivity against pathogen bacterials other than Vibrio salmonicida, Flavobacteriaceae bacterium causing fish diseases. Methanol extraction of Streptomyces sp. ACT-18 in its cultivated liquid showed overall high sensitivity against S. iniae, S. parauberis (>200 ㎍／㎖) and vibriosis causing bacteria (>100 ㎍／㎖) and gliding bacterial disease (>100 ㎍／㎖) and it showed no sensitivity against edward syndrome causing bacteria. As the result for measuring antioxidation activation for each density of methanol extraction from isolated strains broth, DPPH radical scavenging activation(RSA) was found to be 46％ for SBME-1 (Streptomyces Broth Methanol Extract ACT-1) 100 ㎍／㎖, 53％ for 500 ㎍／㎖, 53％ for 1,000 ㎍／㎖ and 67％ for 1,000 ㎍／㎖. Although there is no meaningful difference for NBME-11 (Nocardiopsis Broth Methanol Extract ACT-11), SBME-18 (Streptomyces Broth Methanol Extract ACT-18) showed the highest radical scavenging activation(RSA) of 74％ against SBME-18 (Streptomyces Broth Methanol Extract ACT-18). As the result of hydroxyl radical scavenging activity, it showed antioxidation - XI - activities of 46％ for addition of NBME-11 (100 ／㎍ ㎖) and 38％ for addition of NBME-11 (100 ㎍／㎖), whereas it showed higher antioxidation activation of 84％ for SMBE-1 and 81％ for SBME-18 at more than 500 ㎍／㎖ of density. As the result of Alkyl radical scavenging activity, all experimental bacterials showed increase of antioxidation activation depending on density and addition of 100 ㎍／㎖ showed low radical scavenging activation (30~40％). Extraction of SBME-18 at experimental of 1,000 ㎍／㎖ showed the highest radical scavenging activation of 74％. In addition, antimicrobial and antioxidation activation are measured for separated substance of strains for each organic solvent fraction. As the result, antimicrobial activation of separated from Streptomyces sp. ACT-1 showed no significance against polaric water solvent, but it showed antimicrobial activation against solvent of chloroform, n-hexan. Experiment of fraction hexane and chloroform showed antimicrobial activation significantly against bacteria causing streptococcosis and it showed overall weak antimicrobial activation against vibrio disease-causing bacteria. As the result of measuring antimicrobial activation for each Streptomyces sp. ACT-18 fraction, it showed strong antimicrobial activation for most of disease-causing bacterials in chloroform fraction, but it showed strong antimicrobial activation against S. iniae, S. parauberis in n-hexan fraction but it showed weak one against vibrio and no sensitivity for wild type Exiuobacterium oridotokrans. As the result of antioxidation activation, it showed the highest DPPH radical scavenging activation for Streptomyces sp. ACT-1 chloroform fraction and it showed very high radical scavenging activation of 89％ at density of 1 ㎎／㎖. DPPH radical scavenging activation of Streptomyces sp. ACT-18 fraction showed the highest radical scavenging activation at chlroloform fraction. As the result of Hydroxyl radical scavenging activity it showed the highest scavenging activity at Streptomyces sp. ACT-1 n-butanol fraction with radical scavenging activation of 58, 69 and 74％ for Streptomyces sp. ACT-18 hexane fraction. As the result of alkyl radical scavenging activation , it shows the highest radical scavenging activation at Streptomyces sp. ACT-1 - XII - ethyl acetate fraction and showed scavenging activation of 66％ at density of 0.5 ㎎／㎖. Alkyl radical scavenging activation for each density of Streptomyces sp. ACT-18 fraction was highest for hexane fraction and showed 35.4, 60, 76.1％ at 0.1, 0.5, 1 ㎎／㎖ respectively. Experiment of bio-contact for cultivating fishes was performed using extracted substance from Streptomyces sp. ACT-1, Streptomyces sp. ACT-18 which is marine actinomycetes strain. As the result, growth rate for Paralichyhus olivaceus was found to be 154.4 g during its cultivating period at control of no addition of actinomycetes extract. And it was found to be 174.3 g with addition of feeding material of SBME-18of 1％. In order to check effects for biological condition of Paralichyhus olivaceus from addition of feed of actinomycetes extract, variations of glutamic oxalacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT), Total protein, Glucose, Phosphorus, Triglycerides, Hemoglobin was examined. As the result of this examination from comparison of GOT in blood, a little low enzyme was found at experimental control with addition. And it has no meaningful difference after comparing with comparison control. And GPT enzyme had no meaningful differences either, thus there was no damage of internal organ from addition of feeding substance. The content of Glucose tended to be increased at comparison control, and it showed lowed content of Glucose at experimental control with addition of feeding substance, and Total protein, TG (Triglyceride), Phosphorus had no meaningful difference. Hemoglobin was found to be increased at experimental control with addition of feeding material. After measuring secretion of LDH enzyme, there was no meaningful difference at all experimental controls(Not shown data). As the result of measuring oxygen free radical in phagocyte of fishes, phagocyte activation was found to be higher at all experimental controls with addtion of feeding material from actinomycetes extract than controls with general feeding materials, and it was very high at experimental controls with lactic acid bacteria of 2％. Lysozyme was found to be high lysozyme activation at control with addition Streptomyces sp. ACT-1 - XIII - extract 2％. 15 days accumulated mortality rate for Paralichyhus olivaceus was checked after healthy Paralichyhus olivaceus during 13 weeks with addition of feeding actinomycetes extract is forced infected with fish pathogen bacteria Streptococcus iniae. As the result, death occurred in control with general feeding material at day 2 since forced infection and it continuously increased showing death rate of 80％ at day 10. Mortality rate of 60％ was shown at experimental control with addition of ACT-1 of 2％, and it showed reduction of 20％, and overall death rate of 15~20％ was shown.