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큰잎모자반 효소추출물의 항산화 및 항암활성 연구

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Abstract
이 연구에서는 큰잎모자반을 상업용효소인 Celluclast와 Neutrase를 이용하여 효소적방법으로 수용성 추출물을 제조하여 이들의 항산화활성과 항암활성에 대해 연구하였다.
큰잎모자반(Sargassum coreanum) 유기용매 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 Chloroform과 Ethylacetate 획분에서 81% 정도의 활성을 나타냈고, 수용액 획분에서 가장 낮은 2.55%의 활성을 나타냈다. Ferrous ion 활성은 n-Haxane에서 68.61%로 가장 높았으며 Chloroform 추출물은 12.41%로 가장 낮게 나타났다. H₂O₂소거활성은 대부분이 80% 이상의 활성을 보였다. 총 폴리페놀함량은 Ethylacetate와 Ethanol에서 각각 0.1764 ㎎/㎖와 0.1729 ㎎/㎖로 n-Hexane의 0.0294 ㎎/㎖ 보다는 높게 나타났다.
당분해효소나 단백질분해효소 모두다 DPPH 라디칼 소거활성은 88% 이상을 나타내었고, Neutrase 효소추출물은 거의 93%의 소거활성을 보였다. H₂O₂소거활성에서도 Neutrase와 Celluclast 효소추출물이 다른 효소추출물보다 다소 높은 소거활성을 나타내었다. DPPH 라디칼 소거활성과 H₂O₂소거활성에서 활성이 높았던 Neutrase와 Celluclast 추출물을 분자량별 분획하여 5 kDa<, 5∼10 kDa, 10∼30 kDa >30 kDa 분획물을 얻어 항산화 활성을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성에서는 >30 kDa 분획물이 다른 분획물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성이 높았고 현재 상용되어지고 있는 항산화제 BHA, BHT 및 α-tocopherol 보다도 약간 높은 유해산소 소거율을 보였다. H₂O₂소거활성에서는 Neutrase와 Celluclast 효소추출물의 5~10 kDa 분획물이 다른 분획물보다 높은 소거활성을 나타내었으며, 분자량별 분획물의 농도별에서도 같은 결과가 나왔다. DPPH 라디칼 소거활성도 각각 80% 이상 나타내었다.
세포상에서 큰잎모자반 Celluclast와 Neutrase 추출물의 5~10 kDa 분획물의 H₂O₂ 소거활성은 100 ㎍/㎖에 약 70% 정도의 활성을 나타내었으며 H2O2에 의해 손상을 받은 V79-4 세포에 대한 세포사멸 억제효과는 Celluclast와 Neutrase의 5~10 kDa 분획물 모두에서 농도 비례적으로 세포 생존율이 증가하였으며 농도가 100 ㎎/㎖ 약 70%의 우수한 세포 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
Alkaline comet assay를 이용하여 H₂O₂처리로 손상된 L-5178 세포의 DNA 손상에 대한 Celluclast 추출물 5~10 kDa 분획물의 농도별 처리에 따른 세포손상 저해효과는 H₂O₂를 처리하지 않은 대조구에서 약 7% 세포손상을 보였고, H₂O₂를 처리하였을 때 약 50%의 높은 DNA 손상을 입었다. 반면 효소분획물을 100 ㎍/㎖를 처리하였을 때 약 15% 정도의 DNA 손상만을 보였다. 농도에 따른 세포손상 저해효과는 25 ㎍/㎖의 농도에서는 30% 정도였고, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 약 70%이 높은 세포손상 억제효과를 보였다. Neutrase 추출물 5~10 kDa 분획물의 농도별 처리의 결과도 Celluclast 추출물과 유사한 결과를 나타내었다.
V79-4 세포를 H₂O₂ 처리 후 분획물의 농도별 처리에 따른 apoptosis 유도 억제효과는 H₂O₂만을 V79-4 세포에 처리하였을 때 H₂O₂를 처리하지 않은 대조구에 비해 apoptotic body가 많이 관찰되는 것을 확인하였다. 반면 Celluclast 5~10 kDa 분획물을 100㎍/㎖의 농도를 처리하였을 때 거의 대조구와 유사한 형태를 유지하였고, Neutrase 추출물 5~10 kDa 분획물의 경우는 Celluclast와 비교하며 다소 떨어지는 apoptosis 유도 억제효과를 보였다. 그리고 apoptosis 유도 억제 효과를 보기위한 또 다른 방법으로 flow cytometry를 이용하여 측정하였다. flow cymetry로 측정한 결과 H₂O₂를 처리하지 않은 대조군의 sub-G₁가 1.52%인 반면 H₂O₂에 의해 유도된 V79-4 세포의 apoptosis를 나타내는 sub-G1은 18.5%로 크게 증가하였으나 100 ㎍/㎖ Celluclast의 5~10 kDa 분획물 첨가시 apoptosis나타내는 sub-G₁은 1.8%로 거의 대조구와 유사한 apoptosis를 보였다. 이것은 Celluclast의 5~10 kDa 분획물의 첨가가 H₂O₂ 에 의해 손상된 V79-4의 apoptosis 유도를 효과적으로 억제되었다는 것을 확인할 수 있었다.
Neutrase의 5~10 kDa 분획물의 apoptosis 유도억제 효과에서 H₂O₂에 의해 손상된 V79-4 세포에 대한 cell cycle 변화를 측정한 결과는 대조구의 sub-G₁의 1.52%인 반면 H₂O₂에 의해 유도된 V79-4 cell의 apoptosis sub-G₁은 18.5%였으나 100 ㎍/㎖ Neutrase의 5~10 kDa 분획물 첨가시 apoptosis를 나타내는 sub-G₁은 2.68%로 낮아진 것으로 보아 Neutrase의 5~10 kDa 분획물의 첨가가 H₂O₂에 의해 손상된 V79-4 세포의 apoptosis 유도를 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
큰잎모자반 Neutrase 추출물의 5~10 kDa 분획물의 농도별 처리에 따른 V79-4 세포의 항산화효소 SOD와 CAT의 활성은 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 처리시 SOD 활성이 각각 21%, 38% 및 67%씩 증가하였다. CAT의 경우는 각각 9.6%, 24% 및 45%씩 증가하였다.
Celluclast 추출물의 경우 SOD와 CAT의 활성은 25, 50 및 100 ㎍/㎖씩 처리시 SOD 활성이 각각 16%, 36% 및 58%씩 증가하였다. CAT의 경우 각각 15%, 23% 및 41%씩 증가하였다.
CT-26, U-937, HL-60, B-16과 Hela 세포에 대한 Celluclast와 Neutrase 효소분획물의 세포성장 억제효과는 다른 분획물에 비해 >30 KDa 분획물이 U-937와 HL-60 cell에 대해 높은 성장억제 효과를 나타내었으며, U-937 cell에 더 효과적이었다.
U-937와 HL-60 세포에 대한 분획물의 농도별 성장억제효과는 농도 의존적으로 세포성장 억제효과를 보였으며, 암세포에 효소분획물을 처리하였을 때 시간대별 DNA 손상정도는 시간이 증가할수록 DNA 손상도 증가하였고 12시간 경과한 후에는 HL-60 세포에 대해 약 40~50%의 DNA 손상을 보였다. 농도별 HL-60과 U-937 세포에 대한 DNA 손상 측정 결과는 200 ㎍/㎖의 농도에서는 약 25~30%의 DNA 손상을 나타냈다.
Lymphocyte 세포(정상세포)에 대한 큰잎모자반 Celluclast와 Neutrase >30kDa 분획물의 DNA 손상 측정 결과 두 효소 모두 100 ㎍/㎖의 농도까지는 효소추출물을 처리하지 않은 대조구와 비슷한 DNA 손상 결과를 나타냈으나 200 ㎍/㎖의 농도에서는 대조구에 비해 약간의 Lymphocyte 세포의 DNA 손상이 나타났다.
Neutrase 추출물의 >30 kDa 분획물의 U-937 cell에 대한 cell cycle 변화를 측정한 결과 효소추출물을 처리하지 않은 대조구의 경우 apoptosis를 나타내는 sub-G₁는 약 3.15%였던 것이 Neutrase 추출물의 >30 kDa 분획물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖와 200 ㎍/㎖를 처리 하였을 때 sub-G₁이 각각 3.10%, 3.25%, 15..66%로 증가하는 것을 보였다. Celluclast 추출물의 경우도 Neurase 추출물과 비슷한 경향을 보이며 대조구의 sub-G₁는 3.15%였던 것이, Neurase 추출물의 >30 kDa 분획물을 200 ㎍/㎖를 처리하였 을 때 sub-G₁이 증가하는 것을 보였다 (17.74%).
Neutrase 추출물의 >30kDa 분획물을 가지고 HL-60 cell에 대한 cell cycle 변화를 측정 결과 추출물을 처리하지 않은 대조구와 Neutrase 추출물의 >30 kDa 분획물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖와 200 ㎍/㎖를 처리하였을 때 apoptosis를 나타내는 sub-G₁은 각각 2.91%, 4.33%, 6.21%와 14.45%를 나타내었으며, Celluclast 추출물의 경우는 대조구의 sub-G₁은 2.91%였고, 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖와200 ㎍/㎖를 처리하였을 때 sub-G₁은 각각 5.02%, 5.63%와 16.21%의 수치를 나타내었다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, 큰잎모자반 효소적 추출물이 식품에서 사용가능한 안전한 수용성 물질이고, 활성산소종의 하나인 H₂O₂를 효과적으로 제거시키고, 또한 암세포의 증식을 억제하는 것으로 볼 때 산업적 용도가 매우 다양할 것으로 추정되며, 특히 식품산업으로서의 이용 가능성을 높일 수 있을 것이라 판단된다. 또한 기존의 항산화제 및 항암제가 갖고 있던 인체 안전성 문제도 충분히 극복할 수 있을 것으로 기대된다.
In this study, Sargassum coreanum was enzymatically hydrolyzed to prepare water-soluble extracts by using five carbohydrates(Viscozyme, Celluclast, AMG, Termamy and Ultraflo) and five proteases(Protamax, Kojizyme, Neutrase, Flavourezyme and Alcalase) and evaluated their potential antioxident activity.
The Celluclast and Neutrase extracts of Sargassum coreanum exhibited better DPPH radical scavenging activities(92.42% and 92.78%, respectively) and hydrogen peroxide(H2O2) scavenging activities(58.28% and 57.97% respectively) compared to other enzymatic extracts. Celluclast and Neutrase extracts were fractionated using millipore's Labscale TFF system with ultrafiltration membrane(5kDa, 10kDa and 30kDa). The resultant fractions were collected according to the molecular weight(<5kDa, 5~10kDa, 10~30kDa and >30kDa). Among all the fractions, 5~10 kDa fraction showed the highest H₂O₂ scavenging activity and >30kDa fraction showed the highest DPPH radical scavenging activity. Also, 5~10kDa fraction strongly enhanced cell viability against H₂O₂-induced oxidative damage in the chinese hamster lung fibroblast(V79-4) cell line.
Celluclast and Neutrase extracts of Sargassum coreanum were examined for a potential antitumor activity against five tumor cell lines such as CT-26(mouse colon carcinoma line), U-937(human monoblastoid leukemia cell line), HL-60(human promyelocyte leukemia cell line), HeLa(woman cervical carcinoma cell line) and B-16(murine melanoma cell line)>30kDa fraction inhibited cell growth on the two tumor cells than the other fractions. Especially the fraction significantly showed inhibition of cell growth against U-937 cell and HL-60 cell.
Therefore the dose-dependent effect of >30kDa fraction on U-937 cell and HL-60 cell were further investigated and the results are showed clear dose-depentent antitumor activity on U-937 cells and HL-60 cells.
It was also revealed that >30kDa fraction increased DNA fragmentation, apoptotic body and sub-G1 DNA contents in U-937 cell and HL-60 cell. These results indicate that >30kDa fraction of Sargassum coreanum Celluclast and Neutrase extracts can control U-937 cells and HL-60 cells through apoptosis. Therefore, >30kDa fraction has a potential antitumor activity.
Author(s)
양현필
Issued Date
2007
Awarded Date
2007. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000003879
Alternative Author(s)
Yang, Hyun-Pil
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생물공학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
서론 = 7
Part Ⅰ: 큰잎모자반(Sargassum coreanum) 유기용매 분획물 및 효소추출물의 항산화활성 측정 = 12
1. 요약 = 12
2. 재료 및 방법 = 12
2-1. 재료 = 12
2-2. 큰잎모자반의 일반성분 분석 = 13
2-3. 큰잎모자반 유기용매 분획물 제조 = 13
2-4. 큰잎모자반 효소추출물 제조 = 14
2-5. 큰잎모자반 효소추출물의 분자량별 분획물 제조 = 16
2-6. DPPH free radical scavenging activity = 16
2-7. Hydrogen peroxide scavenging activity = 16
2-8. Metal chelating assay = 19
2-9. Total polyphenolic assay = 19
3. 결과 = 20
3-1. 큰잎모자반의 일반성분 분석 = 20
3-2. 큰잎모자반 유기용매 분획물의 수율 = 20
3-3. 큰잎모자반의 유기용매 추출물의 라디칼 소거활성 = 23
3-4. 큰잎모자반 효소추출물의 분자량별 수율 = 26
3-5. 큰잎모자반의 효소추출물의 라디칼 소거활성 = 26
4. 결론 = 35
Part Ⅱ : 큰잎모자반(Sargassum coreanum) 분자량별 분획물의 H₂O₂ 처리에 따른 V79-4 세포의 세포손상 보호효과 = 37
1. 요약 = 37
2. 재료 및 방법 = 38
2-1. 재료 = 38
2-2. 큰잎모자반 효소추출물의 분자량별 분획물 제조 = 38
2-3. 세포배양 = 39
2-4. Cell 상에서의 hydrogen peroxide 소거활성 = 39
2-5. 형광현미경을 이용한 cell의 형태적 관찰 = 40
2-6. Cell viability 측정 = 40
2-7. Nuclear staining with Hoechst 33342 = 40
2-8. Alkaline comet assay를 이용한 DNA 손상 측정 = 41
2-9. Flow cytometry analysis = 42
2-10. 항산화효소 분석 = 42
2-11. 통계분석 = 43
3. 결과 = 43
3-1. Cell 상에서의 hydrogen peroxide 소거활성 = 43
3-2. 효소분획물의 H₂O₂ 처리 V79-4 cell의 세포사멸 억제효과 = 44
3-3. 효소분획물의 H₂O₂ 처리 V79-4 cell의 형태적 변화 = 45
3-4. 효소분획물의 H₂O₂ 처리 L-5178 cell의 DNA 손상변화 = 51
3-5. 효소분획물의 H₂O₂ 처리 V79-4 cell의 cell cycle 변화 = 58
3-6. 효소분획물 첨가시 V79-4 cell의 항산화효소 변화 = 62
4. 결론 = 66
Part Ⅲ : 암세포에 대한 큰잎모자반(Sargassum coreanum) 분자량별 분획물의 apoptosis 유도 및 항암활성 = 70
1. 요약 = 70
2. 재료 및 방법 = 71
2-1. 재료 = 71
2-2. 큰잎모자반 효소추출물의 분자량별 분획물 제조 = 71
2-3. 세포배양 = 72
2-4. Nuclear staining with Hoechst 33342 = 72
2-5. Cell growth inhibition activity 측정 = 72
2-6. 형광현미경을 이용한 cell의 형태적 관찰 = 73
2-7. Alkaline comet assay를 이용한 암세포의 DNA 손상 측정 = 73
2-8. Flow cytometry analysis = 74
2-9. 통계분석 = 75
2-10. Western blot analysis = 75
3. 결과 = 75
3-1. Cell growth inhibition activity 측정 = 76
3-2. 형광현미경을 이용한 cell의 형태적 관찰 = 83
3-3. Alkaline comet assay를 이용한 암세포의 DNA 손상 측정 = 89
3-4. Lymphocyte cell(정상세포)에 대한 >30kDa 분획물들의 독성효과 = 103
3-5. 효소분획물의 U-937 cell과 HL-60 cell에 대한 cell cycle 변화 = 107
4. 결론 = 117
참고문헌 = 120
감사의 글 = 134
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
양현필. (2007). 큰잎모자반 효소추출물의 항산화 및 항암활성 연구
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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