해양미생물 Phaeobacter inhibens KJ-2의 분리 동정 및 이차대사산물의 항균 활성 탐색

Abstract

어류 양식 산업의 급격한 성장과 증대로 인해 해마다 어류질병에 의한 피해는 날로 증가 하고 있으며, 이를 치료하기 위한 무분별한 항생제의 사용으로 내성균의 출현과 어체내 약품 잔류로 문제가 되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 다각적인 방법을 모색 하고 있으며, 그 중 생물학적 제어에 관한 관심이 증가하고 있다. 최근 항균물질을 생산하거나 경제적 저해를 유발하는 세균이 검출되고 있으며, 많은 연구가 진행 중에 있다. 본 연구는 양식업에 막대한 경제적인 손실은 가져다주는 세균성 어류질병인 Vibrio anguillarum을 예방하고 control 하기 위한 생물 전구체(Probiont)의 개발에 목적을 두고, 해양생물 군소알로부터 특징적인 균주를 분리 하였다. 이를 형태학적 관찰, 염기서열 분석, 생화학적 특성을 통해 균을 동정하여 Phaeobacter inhibens KJ-2로 명명하였다. P. inhibens는 최근 항균물질의 황을 함유한 tropodithietic acid(TDA)로 알려졌다. KJ-2 균주는 비브리오에 대해 강한 항균 활성을 갖고 있다는 연구에 따라 잠재적인 어류질병예방 및 치료제로서 가치가 있어 항균물질의 생산특성을 배양조건에 따라 검토하였으며, 그 결과 20℃에서 24시간 배양 후 항균활성이 최대였고, 배양 4시간 후부터 생육도는 낮았으나 항균물질생산을 시작하였다. 생육도가 거의 없는데도 불구하고 항균물질이 생산이 이루어졌는데, 이는 QS(quorum sensing)의 신호 물질인 AHLs과 관련이 있다고 사료되며, AHLs의 생성능은 항균 활성과 거의 일치함을 알 수 있었다. 이런 배양특성을 바탕으로 항균 활성을 검토한 결과 V. anguillarum에 대해 강한 항균활성을 보였으며, 다른 Vibrio spp.에 대해서도 항균활성을 나타내었다. 특히 Vibrio vulnificus, Vibrio campbellii, Vibrio mimicus에 대해 높은 저해능을 나타내었다. P. inhibens KJ-2의 항균물질 생산을 위한 조건은 1.5% sorbitol, 0.8% NH4NO3, 4% NaCl이며, pH 6, 최적 온도는 20℃이었다. 하지만 무기염류를 첨가 했을시 몇몇 무기염류를 제외하고 생육 및 항균물질 생산을 저해 하였다. 위의 항균물질 생산에 미치는 영향에 일반적인 미생물과 달리 항균물질의 생산의 항균 물질 외에 다른 요소가 작용하는 것을 관찰 할 수 있었다. 즉 색소, AHLs의 생성과 항균활성은 대부분 일치 하였으며, 따라서 P. inhibens KJ-2의 항균물질 생산에 QS가 관련이 있다고 사료된다. P. inhibens KJ-2 antibiotic을 제조하여 항균활성 및 안정성 등을 조사하였다. KJ-2 antibiotic은 어류질병 및 인체 유해균 등에 대해 강한 항균 활성을 나타내었으며, 121℃에서 15분간 고압열처리를 하여도 항균활성을 유지 하였고, pH에 대한 안정성은 약알칼리성에서 다소 항균활성이 감소했지만 대부분 안정하였다. P. inhibens KJ-2 antibiotic의 V. anguillarum에 대한 항균 기작을 검토하기 위해 주사전자현미경(SEM)을 통하여 세포변화를 관찰 하였으며, P. inhibens KJ-2의 항균물질은 초산이나 유산균 같이 세포벽을 붕괴시킴으로써 생육을 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서 P. inhibens KJ-2는 어류질병을 예방하거나 치료 할 수 있는 생물 전구체(Probiont)로써 이용이 가능할 것으로 판단되며, 본 균주의 항균 물질 생산에 관여하는 다양한 요소들에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 생물접촉 실험 등을 통하여 생물전구체로써의 이용 가능성을 충분히 검증 할 필요가 있다고 생각 된다.

This study was conducted to investigate the possible use of probiotics in fish farming by evaluating the in vitro antagonism of antimicrobial strain Phaeobacter inhibens KJ-2 strain against the fish-pathogenic bacterium Vibrio anguillarum. A bacterial strain that showed ability to produce antimicrobial compound was isolated from marine organism Sea hare eggs. Identified bacterial strain was named as Phaeobacter inhibens KJ-2 based on the biochemical characterization and 16S rRNA sequence analysis. Phenotypic classification results showed that Phaeobacter inhibens KJ-2 could be classified as a aerobic, Gram-negative, motile bacteria that forms brown-pigmented colonies. Production of antimicrobial compound and higher growth of P. inhibens KJ-2 were observed at 20℃ for 24 hours. Production of antimicrobial compound was determined in concordance with acylated homoserine lactones (AHLs) production. Therefore, it could be suggested that production of P. inhibens KJ-2 antimicrobial compound is regulated by Qurom sensing. The identified P. inhibens KJ-2 bacteria showed potent antibacterial activity against pathogenic bacteria including Vibrio logei, Vibrio campbellii, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus, Vibrio salmonicida. Additionary, we identified that V. angurillarum cell wall was damaged after 3h incubation of P. inhibens KJ-2 antibiotic compound using the scanning electron microscope. Optimum conditions for production antimicrobial compound of P. inhibens KJ-2 were determined as media containing 1.5% sorbitol, 0.8% NH4NO3 4% NaCl with pH 6.0 and temperature at 20℃. However, production of antimicrobial compound was inhibited by mineral sources. A antimicrobial compound of P. inhibens KJ-2 was stable within the pH range from 3∼10 and temperature ranging from 40∼121℃. However, antimicrobial activity was decreased pH range from 9∼10. Therefore, our results confirmed that antibiotic compound isolated from P. inhibens KJ-2 has provided a potential biological agent for controling fish pathogenic bacteria.