감귤 유래 폴리메톡시플라본 노빌레틴의 염증 억제 작용 및 기전

Abstract

PART 1. 제주 감귤 과피 추출물의 플라보노이드 함량 분석 및 LPS로 활성화된 대식세포주 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 미치는 영향: 감귤 과피 추추물의 NO 생성 억제 활성에 대한 노빌레틴 함량의 기여 감귤의 과피는 중국전통의학과 서양근대의학에서 염증을 포함한 다양한 질병의 치료를 위하여 사용되었다. 감귤 과피에는 다양한 생리활성을 나타내는 플라보노이드들이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며 플라보노이드의 함량 및 분포는 유전적 요인 뿐 만 아니라 환경적 요인에 의해서도 변이가 매우 높은 것으로 보고되었다. 염증과 암은 감귤 유래 플라보노이드의 생물학적 활성 연구에 있어서 핵심이 되는 분야들로서 감귤 유래 플라보노이드의 각각 또는 혼합물이 in vitro 및 in vivo에서 항염 및 항암 작용을 나타내는 것으로 보고되었다. 세포의 염증반응에서 과다한 nitric oxide (NO)의 생성은 만성 염증 및 암화 과정을 포함한 다양한 병리생리학적 작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에 저자는 제주도에서 재배되고 있는 육성품종을 포함한 20종의 감귤류의 과피로부터 얻은 70% 에탄올추출물에서 1) 감귤 유래 플라보노이드 중 생리활성이 높은 것으로 보고된 나린진, 나린제닌, 헤스페리딘, 헤스페레틴, 루틴, 노빌레틴 및 탄저레틴의 함량을 HPLC를 사용하여 조사하고, 2) lipopolysaccharide (LPS)로 활성화된 대식세포주 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 억제 활성을 관찰하였으며 3) 감귤 과피 추출물에서 플라보노이드 함량과 NO 생성 억제 효능과의 상관성을 살펴보았다. 1. 분석한 플로보노이드 함량 및 LPS로 활성화된 대식세포 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 억제 활성은 감귤종에 따라 다르게 나타났다. 2. 폴리메톡시 플라본인 노빌레틴과 탄저레틴의 함량은 서로 높은 양의 상관성을 나타냈다. 3. 미성숙 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물 보다 유의적으로 더 많은 플라보노이드를 함유하고 있었다. 4. 분석한 모든 감귤 과피 추출물은 농도의존적으로 NO 생성에 대한 억제 활성을 보였으며, 미성숙 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물보다 유의적으로 높은 억제 활성을 나타냈다. 5. 플라보노이드 함량과 NO 생성 억제 활성과의 연관성 분석 결과는 감귤 과피 추출물의 NO 생성 억제 활성이 노빌레틴의 함량과 높은 양의 상관성을 가지는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 감귤 과피 추출물의 플로보노이드 함량 및 LPS로 활성화된 NO 생성 억제 활성은 감귤종에 따라 다르게 나타나며, 노빌레틴의 함량이 감귤 과피 추출물의 NO 생성 억제 효능에 기여한다는 것을 알 수 있었다. 이는 노빌레틴을 다량 함유하고 있는 감귤종은 과다한 NO의 생성으로 초래되는 질병에 대해 보호 효과를 제공할 수 있음을 알게 해준다. PART 2. LPS에 의한 RAW 264.7세포의 염증작용에 대한 노빌레틴의 항염증 효과와 NF-κB 신호 전달 경로에 관한 연구 노빌레틴(nobiletin)은 감귤 과피에 다량으로 존재하는 것으로 알려진 폴리메톡시 플라본이며 in vitro 및 in vivo에서 뛰어난 항염 효과가 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 노빌레틴의 항염 작용에 대한 자세한 분자적 기전은 아직까지 알려져 있지 않다. 이에 저자는 기존의 연구 결과들에 근거하여, 노빌레틴의 항염 작용의 분자적 기전을 이해하기 위해서 면역 및 염증과 관련된 유전자들의 발현 조절에 관여하는 nuclear factor-kappaB (NF-?B)의 활성화 경로에 대한 노빌레틴의 영향을 LPS로 활성화된 대식세포주 RAW 264.7 세포에서 관찰하였다. 이를 규명하기 위하여 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 이용하여 NF-κB의 DNA 결합 활성, luciferase 분석법을 이용하여 NF-κB의 전사 활성, western blot 분석법을 이용하여 NF-κB의 핵으로의 이동 및 inhibitory-κB-alpha (IκBα)의 인산화 및 분해 활성에 미치는 노빌레틴의 영향을 살펴보았다. 1. 노빌레틴은 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 염증매개인자들인, NO, prostaglandin E2 및 전염증성 사이토카인 tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta 및 IL-6의 생성을 전사수준에서 억제하였다. 2. 노빌레틴은 핵내에서의 NF-κB의 전사 활성 및 DNA 결합 활성을 억제하였다. 3. 노빌레틴은 NF-κB의 핵내로의 이동 경로에 관여하는 IκBα?의 인산화 및 분해 활성과 NF-κB의 핵내 이동에는 영향을 미치지 않았다. 4. 노빌레틴은 LPS로 매개되는 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하였다. 이러한 결과는 노빌레틴이 NF-κB의 핵내 이동 경로에는 영향을 미치지 않고 NF-κB와 DNA 결합 부위간의 결합 활성을 저해하여 염증매개인자들의 유전자 발현을 억제 함으로써 염증 억제 효능을 가진다는 것을 시사한다.

PART 1 The aims of the present study were to determine: 1) the contents of flavonoids in the fruit peel of 20 citrus species (including cultivars) within the Citrus genus grown on Jeju Island, 2) the inhibitory effect of citrus fruit peel on lipopolysaccharide (LPS)-induced NO production in RAW 264.7 cells, and 3) the relationship between the flavonoids contents of the citrus fruit peel and its inhibitory effect on NO production. Using 70% ethanol extracts prepared from immature and mature citrus fruit peels, the contents of seven flavonoids (naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin, nobiletin, and tangeretin) were determined by HPLC analysis. Each citrus peel extract varied in flavonoid content, but the contents of nobiletin and tangeretin, which were contained in all 20 fruit peels, showed a positive and significant correlation with each other (r = 0.879, P < 0.0005 for immature fruit peels; r = 0.858, P < 0.0005 for mature fruit peels). The ethanol extracts from immature citrus fruit peels have not only higher flavonoids contents, but also a greater inhibitory effect on NO production by LPS-activated RAW 264.7 cells than those of mature citrus fruit peels. All citrus peel extracts dose-dependently inhibited LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells. This inhibitory effect was significantly and positively correlated with the content of nobiletin and tangeretin. From the comparison of the inhibitory activity of each flavonoid, nobiletin , but not tangeretin, showed the most potent inhibitory effect on NO production among the seven tested flavonoids. Taken together, these results strongly suggest that the nobiletin content within citrus fruit peel is a key element in determining the inhibitory activity on NO production by LPS-activated RAW 264.7 cells inherent in each citrus fruit peel. This result supports the promise that nobiletin-rich citrus may provide protection against diseases resulting from excessive NO production. PART 2 Nobiletin (5,6,7,8,3',4'-hexamethoxy flavone), which is a polymethoxylated flavone found exclusively in the peels of citrus fruits, exhibits diverse biological potential. This study investigated the anti-inflammatory activity of nobiletin in terms of its regulation of nuclear factor κB(NF-κB), a transcription factor that is associated with the expression of many immune and inflammatory genes. Nobiletin suppressed the transcriptional activation of NF-κB in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW 264.7 cells. Nobiletin inhibited neither LPS-induced degradation of inhibitory κB-α nor nuclear translocation of NF-κB. However, it interrupted the DNA-binding activity of activated NF-κB. Nobiletin inhibited nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 production through the inhibition of inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 gene expression in LPS-activated RAW 264.7 cells. Nobiletin also inhibited the production of three pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor-α, interleukin-1β and interleukin-6, in gene expression levels. In addition, nobiletin inhibited the production of LPS-mediated reactive oxygen species (ROS) in RAW 264.7 cells. These results indicate that nobiletin inhibits LPS-induced NF-κB activation by interrupting DNA-binding activity without interfering with the nuclear translocation of NF-κB, and that nobiletin suppresses the accumulation of ROS, resulting in redox-based NF-κB activation in LPS-activated RAW 264.7 cells.