MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF ANTIOXIDANT GENES FROM SCUTICOCILIATE, Miamiensis avidus

Abstract

한국 어류양식 산업에 있어서 스쿠티카충에 의한 피해는 매년 증가하고 있는 추세이다. 스쿠티카충은 섬모충의 일종으로 어류의 조직을 파고 먹음으로써 어류의 폐사를 가져온다. 현재 감염성 스쿠티카충 종류에는 Mianiensis avidus, Philasterides dicentrarchi, Uronema nigricans, Tetrahymena sp. 등이 알려져 있다. 이들이 어류 조직에 한번 감염되기 시작하면 조직을 파고 먹어 들어감으로써 혈관을 통해 아가미, 심장, 뇌, 장, 근육조직 등까지 전체적으로 퍼져나간다. 여러 스쿠티카충 중에서도 특히나 Mianiensis avidus는 가장 강력한 감염성을 지녔다는 보고가 있다. 이 종은 어류조직에 감염되면 빠른 속도로 전체조직으로 퍼져나가 대량의 어류폐사를 일으킨다. 그러나 Mianiensis avidu의 대한 연구는 subunit ribosomal RNA (SSU rRNA)에 의한 종 동정과 in vitro 상에서의 배양방법, 감염 시 숙주 어류에서 일어나는 면역반응 등에 대한 것만이 발표되었다. 생물에 있어서 활성산소(reactive oxygen species, ROSs)는 물질대사에 의해 발생된다. 이러한 활성산소는 생물 물질대사에 있어 신호전달이나 면역 등에 중요한 역할을 담당하지만 그 양이 과다하게 되면 세포나 조직에 피해를 주게 된다. 자외선, 약품, 독소, 항체, 대식세포의 면역작용에 의해 활성산소가 과다하게 생성되면, 이들 활성산소들은 단백질, 지질, 색산, 당의 생합성에 영향을 주며, DNA의 변형을 가져오고 결국 세포의 사멸을 가져온다. 이러한 활성산소의 부작용을 막기 위하여 생물체는 여러 항산화 체계를 발달시켜왔다. 그 중에서 항산화 효소로 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPX), catalases (CAT), peroxiredoxin (PRX)가 알려져 있다. SOD는 산소 라디칼(O2•-)을 과산화수소(H2O2)와 산소(O2)로 전환시키는 효소로 활성부위에 어떠한 금속을 갖는 가에 따라 분류된다. 현재, copper/zink containing SOD (CuZn-SOD), Manganese containing SOD (Mn-SOD), iron containing SOD (Fe-SOD), nickel containing SOD (Ni-SOD) 등이 보고되었다. GPX는 SOD에 의해 생성된 H2O2나 유기과산화물을 물이나 알코올 형태로 분해하는 효소이다. GPX의 활성부위에 seleno-cysteine (Se-Cys)을 갖는 GPX가 포유류와 어류, 식물 등에서 주로 보고되었고 몇몇의 종에서 활성부위에 Se-Cys 대신 보통의 cysteine를 갖는 nonselenium GPX (또는 seleno-indenpendent GPX)가 보고되고 있다. 많은 기생충들은 숙주의 면역체계를 방어하기 위해 여러 가지 전략을 가지고 있으며 특히 대식세포에서 분비되는 활성산소나 포식작용을 이겨내기 위한 항산화효소가 발달되어있다. 이미 말라리아충이나 장내 기생하는 nematode 등에서 이러한 항산화효소가 발표되었다. Mianiensis avidus가 스쿠티카충에서도 강력한 공격자로 알려져 있으나 이에 대한 생활사나 분자유전학적 연구가 미미하다. 이에 이 논문에서는 Mianiensis avidus의 항산화 효소인 SOD와 GPX에 대해 분자유전학적으로 분석함으로써 앞으로 이 종에 대한 유전학적, 면역학적 기전 연구에 있어 도움을 주고자 한다. 또한 간접적으로 스쿠티카충이 숙주 면역작용과 여러 환경적 스트레스에 어떻게 살아남는지에 대한 이해를 높이고자 한다.

저자가 속해있는 실험실에서는 이미 Mianiensis avidus에 대한 선행연구로써, 발현되는 유전자에 대해 GS-FLX 분석을 실시한 바 있다. 이를 통해 Mianiensis avidus 유전자들의 contig와 singleton들을 얻었고, GS-FLX blast 결과를 통해 SOD와 GPX로 추정되는 부분 서열을 확인하였다. 이 부분 서열을 토대로 full-length SOD와 GPX를 얻기 위해 RACE PCR 용 primer를 제작하였고, 이를 이용하여 SOD와 GPX 서열을 클로닝 하였다.

클로닝된 Mianiensis avidus SOD (maSOD)는 총길이 958bp로 663bp의 open reading frame (ORF)를 포함하고 있었으며 220 개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 단백질서열 분석을 통해 분자량 약 25 kDa과 isoelectric point (pI, 등전점) 6.65를 확인하였다. NCBI BLAST 분석을 통해 maSOD가 Fe-SOD와 Mn-SOD와 유사하다는 것을 확인하였고 이를 토대로 알려진 여러 Fe-SOD와 Mn-SOD과 비교 및 분석하였다. maSOD에는 Fe이나 Mn과 결합하여 그 기능을 수행할 수 있게 해주는 4개의 amino acid residue를 포함하고 있었으며, Fe/Mn-SOD의 보존된 2개의 motif와 1개의 signature 서열이 있었다. Pairwise ClustalW 분석을 실시하여 maSOD 단백질 서열이 Tetrahymena thermophlia, Tetrahymena pyriformis와 각각 유사성 81, 75 %로 가장 가까웠으며, 다른 Fe/Mn-SOD들과는 45%에서 62%의 유사도를 보였다. maSOD의 계통수와 비교분석을 살펴보면 maSOD가 다른 기생충이나 병원체에서 알려진 Fe-SOD보다 고등진핵생물의 Mn-SOD와 유사함을 알 수 있다. 계통수에서 maSOD의 위치는 Fe-SOD 가지가 아닌 Mn-SOD 가지에 속해있다. 실제로 Fe-SOD와 Mn-SOD는 매우 유사한 서열을 지니고 있으며, 고등생물에서 주로 Mn-SOD가 보고되고 하등생물에서 Fe-SOD가 보고되고 있다. maSOD 단백질의 특성을 알기 위해 재조합단백질을 이용한 항산화효과를 측정하였다. Miamiensis avidus와 같은 섬모충의 유전자를 박테리아인 E. coli에서 발현시키기 위해서는 별도의 과정이 필요하다. 섬모충과 E. coli의 codon usage에 차이가 있기 때문에 maSOD의 발현서열 중에서 E. coli에서 없는 codon들을 E. coli에 특이적인 codon으로 바꿔준 다음, 이 변형된 서열을 기초로 만든 oligodeoxynucleotide와 aseembly PCR를 통해 변형 maSOD ORF를 합성하였다. 'pMALTM protein fusion and purification system'과 E. coli BL21 (DE3)를 이용하여 재조합 단백질을 발현시켜, maltose binding protein (MBP)를 포함한 재조합 퓨전 maSOD를 얻어내었다. 그 다음, 이 재조합 단백질의 최적온도와 최적 pH, maSOD의 금속특성을 확인하였다. 효소활성 실험에서 maSOD는 0℃에서 가장 높은 활성을 보였고 0 ~ 15℃에서 높은 활성을 가졌으며 20℃ 이후부터 그 활성이 급격히 감소하였다. maSOD의 최적 pH는 7.5이며 pH 7.0에서 pH 10까지 전반적으로 높은 활성을 보였다. Fe-SOD와 Mn-SOD가 유사함에 따라 이를 분류하기 위한 실험으로 특정억제제를 이용하여 금속특성을 확인 할 수 있다. 억제제인 H2O2와 NaN3를 처리하였을 때 H2O2를 처리한 maSOD가 억제제를 처리하지 않은 대조구에 비해 활성이 급격히 억제됨을 알 수 있었다. 이를 통해 maSOD가 Mn-SOD와 Fe-SOD의 중간형태를 지녔으나 그 활성을 보아 Fe-SOD임을 확인할 수 있었다.

Mianiensis avidus GPX (maGPX)는 총길이 901bp로 684 bp의 ORF를 포함하고 있으며, 227 개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 분자량은 25 kDa이고 pI는 6.1로 분석되었다. maGPX 아미노산 서열을 NCBI protein BLAST program과 Motif scan, SMART program 으로 분석하였을 때, 활성부위에 Se-Cye 대신 보통의 cysteine을 갖는 seleno-independent GPX로 분류되었다. 또한 포유류의 NS-GPX 달리 1-cys peroxiredoxin (1-cys PRx)의 기능을 가진 것으로 나타났다. maGPX는 알려진 seleno-independent GPX 및 1-cys PRx 와의 비교를 통해, 보존된 활성부위인 PVCTTE를 포함하고 있는 것이 확인되었고, 1-cys PRx의 기능 중 phospholipase A2 활성을 나타내는 유사한 서열도 포함하고 있었다. Pairwise ClustalW 분석을 통해 maGPX는 알려진 NS-GPX와 1-cys PRx 들과 56 %에서 73 %의 큰 유사도를 보였으며 계통수에서는 Se-Cys을 포함한 GPX와는 다른 가지에 속해있었다. maGPX의 단백질적 특성을 확인하기 위해 maSOD와 같은 방법으로 재조합단백질을 얻어내었다. 단백질 활성실험의 기준을 세우기 위한 선행실험에서 재조합 maGPX가 대조구와 비교했을 때 GPX 활성이 없는 것으로 나타났다. 이는 여러 연구에서 재조합 NS-GPX나 1-cys PRx가 in vitro 상에서 peroxidase활성이 나타나지 않을 수도 있다는 것이 보고된 적이 있다. 활성에 관한 실험은 아직 수행 중에 있으며 추가적으로 GPX 활성과, phospholipase 활성 등을 확인하고자 한다.

maSOD와 maGPX 유전자 동정을 통해 Mianiensis avidus 또한 항산화 효소로써 SOD와 GPX를 발현시킨다는 것을 알 수 있었다. 이 논문을 위해 Mianiensis avidus에 산화적 스트레스를 주었을 때 실제로 이들 유전자가 특이적으로 발현되는지 확인하고자 했으나, 실험적으로 큰 유의성을 보이지 않았다. 이는 아직 이 종에 대한 in vivo 실험조건과 기준이 제대로 확립되어있지 않았고, 산화적 스트레스를 줄 수 있는 조건이 확인되지 않았기 때문인가 추측하고 있다. 앞으로 기생섬모충 중 가장 큰 영향력을 보이는 Mianiensis avidus가 실제 숙주 면역체계에 대해서 어떠한 반응을 보이는 지에 대한 여러 분자유전학적 및 면역학적, 생화학적 연구가 진행되어야 할 것이다. 이 논문은 그러한 연구의 기초단계로써 항산화 효소의 유전자를 동정했다는 의미를 가진다고 할 수 있다.