Protective Effect of Eckol against Oxidative Stress Damaged Mitochondria

Abstract

이 연구에서는 감태(Ecklonia cava)로부터 분리 정제한 Phlorotannin 화합물인 eckol의 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 손상에 대한 세포 보호효과와 그 기작에 대해 밝히고자 하였다. 세포 보호기작 연구에 있어서 중요한 항산화효소로 알려진 Mn SOD의 산화적 손상으로부터의 보호 작용을 검색하였다. Eckol은 The human hepatocyte-derived cell line인 Chang liver 세포에서 hydrogen peroxide로 미토콘드리아 ROS와 세포내 칼슘농도를 증가시켰으나 eckol에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 H2O2에 의해 낮아진 ATP의 양을 eckol을 처리함에 따라 ATP양이 증가하는 것도 확인하였다. 따라서 우리는 eckol이 미토콘드리아 ROS의 연관성과 세포내 칼슘농도의 균형을 유지하고 미토콘드리아내의 에너지를 생산하고 조절하는 것을 알 수 있었다. Mn SOD는 산화적 스트레스에 의해 유도되는 미토콘드리아의 세포손상을 저해하는 항산화 효소로서 중요한 역할을 한다. 따라서 Eckol을 Mn SOD 단백질량과 mRNA의 수준을 증가 시켰고, Mn SOD의 효소활성도 증가 시켰다. 에너지항상성을 조절하는 AMP-activated protein kinase (AMPK)와 수명을 연장하는데 주요한 유전자인 Forkhead box O3a (FOXO3a)의 기작은 산화적 스트레스와 연관대어 다양한 세포내 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 Eckol을 처리하였을 때 AMPK와 FOXO3a의 시간 의존적으로 단백질 발현량을 증가시켰고 FOXO3a의 핵 내로의 이동을 유도하였다. Eckol은 AMPK와 FOXO3a 둘 다의 활성을 증가 시켰으며 AMPK의 활성 억제재인 compound C를 처리 하였을 FOXO3a와 Mn SOD의 발현을 억제하였으며, AMPK와 AMPK를 억제하기 위해 siAMPK과 siAMPK를 이식하였을 때 역시 같은 결과를 얻을 수 있었다. 마지막으로 Mn SOD의 산화적 손상으로부터의 보호효과를 확인하기 위해 hydrogen peroxide로 세포 손상을 유도하였으며 Mn SOD특이적 억제재인 DEDTC 처리와 siMn SOD 이식으로 eckol에 의해 유도된 세포보호효과가 상쇄되었다. 이 연구는 eckol이 AMPK와 FOXO3a를 통하여 항산화 효소인 Mn SOD의 증가에 의해 미토콘드리아내의 산화적 손상을 억제시킨다는 내용을 증명하였다.

We have investigated the cytoprotective effect of eckol, which was isolated from Ecklonia cava, a phlorotannin found in E. cava on hydrogen peroxide (H2O2)-induced mitochondrial dysfunction. When H2O2 was used to induce an increase in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in Chang liver cells, eckol treatment decreased high level of ROS. Eckol also attenuated intracellular Ca2+ levels that have been induced by H2O2. Furthermore, eckol recovered ATP levels and succinate dehydrogenase activity that had been decreased by H2O2 treatment. We conclude these results suggest eckol decreased mitochondrial ROS accumulation, balanced intracellular Ca2+ levels, and improved mitochondrial energy production, thus recovering mitochondrial function. Manganese superoxide dismutase (Mn SOD) is an important antioxidant enzyme that plays a role in cytoprotection against oxidative stress induced mitochondria cell damage. Eckol recovered Mn SOD expression both at the level of mRNA and protein in Chang liver cells, resulting in increased Mn SOD activity. Eckol is able upregulate the AMP-activated protein kinase (AMPK)-mediated phosphorylation of Forkhead box O3a (FOXO3a). Eckol enhanced the level of nuclear translocation and activity of Mn SOD which was decreased by H2O2. Specific FOXO3a siRNA and AMPK siRNA attenuated Mn SOD expression, while eckol recovered it. Eckol treatment enhanced the Mn SOD protein expression which was knockdown by Mn SOD siRNA DEDTC (a Mn SOD inhibitor) and Mn SOD siRNA markedly abolished the cytoprotective effect of eckol against H2O2-induced cell damage. These studies demonstrate that eckol attenuates mitochondrial oxidative stress by activating AMPK/FOXO3a-mediated Mn SOD induction.