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Small molecular preparation of flounder fish(Paralichthys olivaceus) muscle and its biological activities

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Abstract
제주도는 사면이 바다라는 지리적인 조건과 무공해 청정해역, 어류의 회유로 및 월동장으로 좋은 어장을 형성하며, 지하해수 개발로 육상양식을 하기에는 최적의 조건을 갖추고 있다. 제주도의 중요한 산업요소 중 하나인 넙치는 국내 양식장의 98%를 차지하고 있는 주요 양식어종으로 매년 25,000톤을 생산하고 있으며, 약 4,000톤을 수출하고 있다. 또한 넙치는 감칠맛을 내는 IMP, glutamic acid의 함량이 높아 횟감으로서 기호성이 높은 어종으로 그에 대한 연구가치가 크다. 현재 Capelin (Amarowicz and Shahidi, 1997), 참치 (Jao and Ko, 2002), 고등어 (Wu et al., 2003), 명태 (Je et al., 2005), 대구 (Thiansilakul et al., 2007), chum salmon (Ono et al., 2003) 및 hoki (Je et al., 2005)등으로부터 얻어진 가수분해물이 항산화, 항고혈압 활성에 탁월하다는 효능이 밝혀져 있지만, 아직까지 넙치에 대한 연구는 되어있지 않다. 따라서 이 연구에서는 넙치 효소적 가수분해물에 대한 생리활성의 평가와 넙치를 우리가 섭취하였을 때, 항산화, 항고혈압에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 복합효소 가수분해를 이용해 평가하였다.
첫 번째 파트에서는 일반적으로 이용되고 있는 단백질 가수분해효소 8종을 이용하여 넙치 근육으로부터 얻은 가수분해물의 항산화 및 ACE 소거 활성을 측정하였다. 단백질 가수분해물 8개 중에서 α-chymotrypsin 가수분해물의 활성이 가장 높았으며 이렇게 선정된 효소를 이용하여 가수분해물의 최적 조건을 설정하기 위해 가수분해 시간(6, 12, 18, 24시간) 과 기질 대 효소비 (1000:1, 500:1, 100:1)를 다양하게 처리하여 가수분해물을 제조하였다. 제조한 가수분해물들의 활성을 측정하여 최적조건 (가수분해 시간 18시간, 기질 대 효소비율 1000:1)을 선택한 후 분자량 크기에 따라 분리를 할 수 있는 한외여과와 겔 여과 크로마토그래피를 순차적으로 이용하여 분리를 하였다. 그 결과 5 kDa 이하의 저분자 물질에서 우수한 항산화 효과와 ACE소거능 측정을 통해 항고혈압에 대한 가능성을 확인하였다.
두 번째는, 넙치를 섭취하였을 때, 우리 몸에 존재하는 장내효소 (Pepsin 및 α-chymotrypsin)에 의해 소화가 진행되면서 어떠한 기능을 갖는지 알아보고자 하였다. 먼저 위에 존재하고 있는 Pepsin 단백질 가수분해효소를 이용하여 기질 대 효소비 (1000:1, 500:1, 100:1) 및 가수분해 시간 (6, 12, 18, 24시간)에 따라 활성을 측정하여 최적조건 (가수분해 시간 18시간, 기질 대 효소 비율 100:1)을 선택한 후 한외여과를 통해 분자량 크기별로 분리를 하였다. 그 결과 5 kDa 이하의 저분자 물질에서 항산화 효과와 ACE 소거 효과가 나타난 것을 확인하였다. 두 번째로는 위에 존재하는 Pepsin과 췌장에 존재하는 α-chymotrypsin 단백질 가수분해 효소에 의한 복합 가수분해 작용에 의한 생리활성을 확인하고자 하였다. Pepsin과 α-chymotrypsin의 복합 가수분해 시간 (0.5, 1, 3, 6, 12시간)에 따른 최적조건을 선택 (Pepsin 가수분해 시간 1시간, α-chymotrypsin 가수분해 시간 12시간)한 후 한외여과를 통해 분자량 크기별로 분리를 하였다. 그 결과 5 kDa 이하의 저분자 물질에서 높은 항산화 효과와 항고혈압에 대한 가능성을 확인할 수 있었다.
위의 결과들을 종합하여 보면, α-chymotrypsin에 의한 넙치 가수분해물로부터 얻어진 저분자 물질은 우수한 항산화 효과와 항고혈압에 대한 가능성을 보여주었고, 장내 효소인 pepsin과 α-chymotrypsin의 복합효소 가수분해물에서의 저분자 물질, 또한 항산화 효과와 항고혈압에 대한 가능성을 보여줌으로서 , 우리는 넙치를 섭취하였을 때, 이와 같은 효능을 기대할 수 있을 것으로 사료되어진다.
Author(s)
고주영
Issued Date
2011
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000005339
Alternative Author(s)
Ko Ju Young
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
국문초록……… ⅴ
LISTOF FIGURES……… ⅷ
LIST OF TABLES…… ⅹ
INTRODUCTION……………… 1
Part I. Antioxidant and ACE inhibition activities on enzymatic hydrolysate of flounder fish
Muscle………… 6
ABSTRACT…............. 7
METERIALS and METHODS
Materials……..…………………………9
Chemicals and reagent……………9
Proximate composition……………………… 9
Preparation of enzymatic hydrolysate
Preparation of enzymatic hydrolysates by eight protein protease…...10
Optimum conditions assay for the active enzymatic hydrolysate……10
Molecular weight fractionation of active enzymatic hydrolysate….… 11
Size exclusion chromatography………11
Measurement of protein content…………………… 11
SDS-PAGE……… 11
Free radical scavenging capacities using ESR spectrometer……………. 12
DPPH radical scavenging activity………… 12
Hydroxyl radical scavenging activity…………………… 12
Alkyl radical scavenging activity…………………… 13
Hydrogen peroxide scavenging activity………13
ACE inhibition activity……………. 14
Amino acid analysis……………………… 14
Statistical analysis………. 15
RESULTS and DISCUSSION…………………… 17
Proximate composition…………… 17
Preparation of enzymatic hydrolysate from flounder fish muscles………… 17
Characterization of flounder fish hydrolysates SDS-PAGE……… 21
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition Activity……………… 21
Optimum conditions assay for the active enzymatic hydrolysate….…… 33
Characterization of α-chymotrypsin hydrolysate SDS-PAGE…….… 36
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition Activity............... 36
Molecular weight fractionation of α-chymotrypsin hydrolysate by substrate to enzyme ratio 1000:1 for 18h…......... 44
Characterization of α-chymotrypsin hydrolysate fractions using ultrafiltrationmembrane SDS-PAGE………………. 44
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibitionactivity……… 47
Size exclusion chromatography………… 50
Part II. Biological activity of enzymatic digests from flounder fish muscle by proteolyticenzymes in human body……………55
ABSTRACT…………………… 56
MATERIALS and METHODS………… 57
Materials…….…………… 57
Chemicals and reagent…………… 57
Preparation of enzymatic digests by proteolytic enzyme in human body…… 57
Preparation of pepsin digests and optimum conditions assay for the active enzymatic digest.................. 57
Preparation of complex enzyme digest and optimum conditions assay for the active enzymatic digest………… 58
Molecular weight fractionation of active enzymatic hydrolysate………… 59
Measurement of protein content………………… 59
SDS-PAGE…………………… 59
Free radical scavenging capacities using ESR spectrometer……60
Hydroxyl radical scavenging activity…………… 60
Alkyl radical scavenging activity………………… 60
Hydrogen peroxide scavenging activity……………… 61
ACE inhibition activity…………………… 61
Statistical analysis………… 62
RESULTS and DISCUSSION………… 63
Preparation of enzymatic digests by proteolytic enzyme in human body……… 63
Preparation of pepsin digests and optimum conditions assay for the active enzymatic
digests…………… 63
Determined optimum conditions for pepsin digests……. 63
Characterization of pepsin digests SDS-PAGE…… 66
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition activity………………. 66
Molecular weight fraction of pepsin digest by substrate to enzyme ratio 100:1 for 18h………………… 73
Characterization of pepsin digest fractions using ultrafiltration membrane SDS-PAGE…………… 73

Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition activity………………… 73
Preparation of complex enzyme digests and optimum conditions assay for the active enzymatic digests…………………. 79
Determined optimum conditions for complex enzyme using pepsin and α-chymo-trypsin protease……… 79
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition activity…………… 79
Molecular weight fraction of complex enzyme digests by hydrolyzed α-chymo-trypsin for 12h after hydrolyzing pepsin for 1h…… 84
Characterization of complex enzyme digest fractions using ultrafiltration mem-brane SDS-PAGE……… 84
Free radicals scavenging capacities using ESR spectrometer and ACE inhibition activity…………… 84
CONCLUSIONS……… 90
REFERENCES…… 91
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
고주영. (2011). Small molecular preparation of flounder fish(Paralichthys olivaceus) muscle and its biological activities
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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