궁천조생 (C. unshiu Marc. Cv. Miyagawa)에서 Mevalonate Diphosphate Decarboxylase 유전자의 분리 및 발현 분석

Abstract

형질전환방법과 생명공학기술은 과수의 조기선발 및 품종개량에 이용할 수 있으며, 과수 육종 년 한의 단축과 경비의 절약으로 과수산업의 비약적인 발전을 기대할 수 있다.이러한 생명공학기술을 이용하여 우수한 품질의 고기능, 고영양성의 감귤 품종을 육성하기 위해서는 먼저 우수한 기존 품종에 목적유전자를 선택적으로 도입할 수 있는 기술개발과 개발된 기술에 이용할 수 있는 다양한 유용 유전자의 확보가 필요하다. 고등 식물에서 이소프렌 (isoprene: C5) 구조를 가지는 isopentenyl 5-phosphate (IPP)와 dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP)물질을 기본 단위로 만들어지는 isoprenoids는 약 22,000개가 넘는 다른 종류의 화합물이 있으며, 자연 생산물의 가장 큰 종류를 구성하고 있는 것 중 하나로 잘 알려져 있다. Isoprenoid는 막 구조 (sterols), 산화 환원 반응 (plastoquinone, ubiquinone), 생장 조절 (gibberellins, cytokinins, brasssinosteroids, abscisic acid), 방어 기작 (phytoalexins) 그리고 자유 라디칼 제거 (carotenoid, tocopherols) 등의 필수적인 역할을 수행 한다. MDDX는 isopentenyl 5-diphosphate 생합성에 작용하는 효소로 mevalonate 5-diphosphate를 ATP와 Mg2+ 에 의존하여 탈카르복실화를 촉매 한다. 본 연구에서는 isoprenoids 생합성에 중요 효소인 MDDX 유전자의 발현 특성을 알아보고, 감귤 형질전환을 위한 유용 유전자를 확보하기 위하여 성숙 과정에 따른 시기별로 quantitative real-time PCR 및 northern blot 분석을 수행 하였으며, 게놈 DNA와 cDNA를 분리하여 MDDX 유전자의 often reading frame (ORF) 염기서열을 분석 하였다. 그리고 MDDX 유전자의 copy 수를 알아보기 위하여 southern blot 분석을 수행 하였다.

1. 궁천조생 품종의 가지변이에 의한 자연발생적 돌연변이에 유전자의 발현량 차이를 알아보기 위해서 성숙 과실에서 The Citrus 300K Microarray 분석을 수행한 결과, 583개의 유전자들이 발현량에 차이를 보였으며, 515개의 유전자가 발현이 증가 되었고, 67개의 유전자가 발현이 감소하였다. 이 중 Arabidopsis thaliana 유전자와 상보성을 보이는 407개의 유전자들 중에 382개의 유전자가 발현이 증가 되었고 25개의 유전자가 억제 되었다. 이 중에서 Carotenoids, Sterols 등의 전구체인 isoprenoid를 합성하는 mevalonate 경로 상에 있는 Mevalonate diphosphate decarboxylase (MDDX) 유전자가 약 2.5배 과 발현됨을 확인하였다.

2. MDDX의 분석을 통해 유전자 간의 특징을 확인하고자 하였다. 궁천조생 일반 과실과 돌연변이 과실의 molecular cloning을 통해 전체 ORF를 포함하는 유전자를 확보하였다. 염기서열 분석 결과를 보면 일반 과실과 돌연변이 과실의 MDDX 유전자 상동성이 일치 하였으며, 궁천조생의 MDDX 유전자는 coding region이 1263bp 이며, 420개의 아미노산을 coding 하였다. MDDX 유전자의 게놈 내에서의 구조를 분석하기 위해 게놈 유전자은행으로부터 해당 DNA를 분리하여 염기서열을 분석 하였다. 분리된 게놈의 크기는 3,731 bp로서, 크기가 210bp, 199bp, 64bp, 64bp, 81bp, 87bp, 158bp, 49bp, 125bp, 226bp 인 10개의 exon과 양말단의 인접 부위가 GT/AG 규칙에 일치하는 186bp, 130bp, 164bp, 96bp, 642bp, 313bp, 88bp, 687bp, 162bp인 9개의 intron으로 이루진 유전자로 구성 되어 있었다. MDDX 유전자 염기서열의 상동성은 Hevea_brasiliensis (AF429386), Arabidopsis_thaliana (AK228357), Panax_ginseng (GQ455989), Solanum_lycopersicum (EU216564), Arnebia_euchroma (DQ631830), Ginkgo_biloba (AY757921) 등의 MDDX 유전자와 nucleotide level 에서 각각 81, 80, 78, 75, 74, 73% 동일하였으며, amino acid level 에서도 역시 같은 수치의 유사성을 나타냈다

3. MDDX 유전자의 시기별 발현 특성 연구를 위해 궁천조생 일반과실과 돌연변이 과실을 발달 단계별로 total RNA를 추출하고, qRT-PCR 분석을 수행하여 Mevalonate diphosphate decarboxylase (MDDX) 의 발현 차이를 확인 하였다. 돌연변이 과실에서 MDDX 유전자의 발현량은 만개 후 30일, 60일, 90일, 120일, 150일, 180일, 210일에 각각 0.8배, 0.9배, 1.3배, 1.4배, 2.4배, 1.3배, 1배 많았으며 궁천조생에 착색되는 시기인 개화 후 약 150일에 돌연변이 과실이 일반과실과 비교하여 MDDX 유전자가 과 발현됨을 확인 하였다.

4. Northern blot 분석을 해본 결과 MDDX 유전자는 만개 후 30일, 150일, 180일, 220일에서 발현이 되는 것을 볼 수가 있었다. 만개 후 control과 mutant에서 30일에 각각 MDDX유전자가 발현 되었으며, 150일 전 까지는 거의 발현 되지 않다가 150일경에 mutant에서 먼저 MDDX가 발현 되었고, control에서는 180일부터 발현되기 시작하였다. MDDX 유전자가 돌연변이 과실에서 성숙 단계별 유전자의 발현량이 다른 것을 확인 하였다.

5. 궁천조생의 MDDX 유전자의 게놈 내 존재 copy수를 확인하기 위하여 Southern blot 분석을 수행한 결과 궁천조생의 MDDX 유전자는 게놈 내에 single copy로 존재 하는 것을 확인 하였다.

6. 궁천조생 일반 과실과 돌연변이 성숙 과실의 외형 및 내형적 특성을 분석한 결과 과실의 횡경, 종경, 무게, 과피 두께, 가용성 고형물 및 유기산 함량은 유의차 (P<0.025)가 없었다. 과실의 과피와 과육의 착색도를 색차계를 사용 하여 궁천조생 일반 과실과 돌연변이 과실을 측정한 결과는 과육에서 L값은 46.5 와 49.2 로 돌연변이 과육이 2.7 낮았으며, a값은 9.2와 7.0으로 2.2 높게 나타났고, b값이 22.6 과 16.0 으로 6.6 높게 나타났다. 과피에서 L값이 60.9와 68.3으로 돌연변이 과피가 7.4 낮게 나타났고, a값이 41.0 과27.7로 13.3 높게 나타났고, b값은 57.3과 68.2로 10.9 낮게 나타났다. 과육과 과피의 값에 대하여 둘 간에 유의차가 있는지 검증하기 위해 t-test 분석을 해본 결과 과육의 a/b 값을 제외한 나머지는 모두 유의성이 있는 것으로 나타났다.

Genetic transformation method and biotechnology is available in the early stage selection and breeding of fruits, Shorten the period of fruit breeding and money savings of the fruit industry can expect a breakthrough. Using such biotechnology, the technical development from which a target gene can be introduced into the excellent existence citrus varieties selectively first and securement of the various useful genes which can be used for developed technology are needed to bring the citrus varieties breeding of the excellent function and quality. In higher plans, isoprenoids have essential role in membrane structure (sterols), rebox chemistry (plastoquinone, ubiquinone), growth regulation (gibberellins, cytokinins, brassinosteroids and abscisic acid), defence mechanism (phytoalexins) and free radical scavenging (carotenoids and tocopherols). Despite their functional and chemical diversity, all isoprenoids are related biosynthetically by a common C5 precursor, isopentenyl diphosphate (IPP). Mevalonate diphosphate decarboxyase (MDDX) catalyzes the ATP dependent decarboxylation of mevalonate 5-diphosphate (MVAPP) to form isopentenyl 5-diphosphate (IPP). In this study, in order to expression patterns of the MDDX gene to key enzyme in isoprenoids biosynthesis for Miyagawa wase (C. unshiu Marc. Cv. Miyagawa) were performed quantitative real-time PCR and northern blot analysis. For the securement of the useful genes for the citrus transformation were performed MDDX gene ORF sequence analysis using on genomic DNA and cDNA subcloning. In addition, in order to MDDX gene copy number were performed southern blot analysis.

1. As the result of The Citrus 300K Microarray analysis, In a comparison of Wild type Miyagawa wase to Mutant ripening fruit, the 583 genes, in total, were 2 folds up-(515) or down-(67) regulated. The 407 genes were matched to Arabidopsis thaliana. The 382 and 25 genes form up- and down-regulated genes, respectively have orthologues in Arabidopsis thaliana genes. Of these, mevalonate diphosphate decarboxylase gene of the catalyze the synthesis of isorenoids was identified about 2.5 fold over expression.

2. MDDX gene of Miyagawa wase recognized 420 amino acids and coding region was 1,263bp. The size of the separated genomic clone was 3,731bp, This gene consisted of 10 exon and 9 intron. The deduced amino acid sequences were compared between Miyagawa wase and other organisms. The sequence of MDDX has the highest homology with Hevea brasiliensis (81%) (GenBank accession number AF429386).

3. By performing qRT-PCR analysis of wild type and mutant fruit was confirmed expression patterns of MDDX gene. Approximately 2.4 fold over expression of MDDX gene was identified day after flowering mutant type fruit in about 150 days compared with wild type in Miyagawa wase coloring.

4. As the result of northern blot analysis, expression patterns of MDDX gene was identified day after flowering 30, 150, 180 and 220 days. MDDX gene expression for day after flowering 30 days was identified for wild type and mutant respectively. 60, 90, 120 days hardly expression, day after flowering 150 days to mutant was expression first. in the study, we was identified in mutant fruit to difference to ripening stage expression patterns of MDDX gene.

5. For the confirmation MDDX gene copy number were performed southern blot analysis. as the result, when processing it in restriction enzyme HindIII, it was possible to conclude that one copy exists in a MDDX gene in the genome by showing band in about 3,600bp, 700bp respectively.

6. Pigmentation of pulp and peel of fruit to use the chroma meter Miyagawa wase wild type and mutant were measured. as the result, Mutations in the pulp and the peel was a more reddish color. Because of fresh fruit varies depending on the color preferences of consumers, so if Miyagawa wase mutant fruits compared with wild type culminated with a more red fruit, can be seen as more attractive.