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Development of Functional Food and Medical Drug Materials Using Antidiabetic Compounds Isolated from Brown Seaweeds

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Abstract
현대사회의 도시화된 생활환경 (운동부족, 스트레스), 과도한 영양섭취를 일으키는 다양한 인스턴트 식품의 범람과 노동력 위주의 경제활동에서 정보통신의 발달로 인한 사회적 업무환경으로의 전환은 과다한 에너지의 저장으로 인하여 발생하는 대사성질환의 발현을 필연적으로 증가시키고 있다. 복합적 증상으로 나타나는 대사성질환의 원인으로 다양한 요소가 존재하지만 가장 중요한 요소로 받아들여지고 있는 것은 인슐린 저항성이다. 따라서 대사성질환의 발병과 깊은 상관관계를 보여주는 당뇨병 (인슐린 저항성을 특징으로 하는 2형 당뇨병 포함)의 증가추세가 두두러짐에 따라 당뇨병은 현재 전세계적으로 급격하게 증가하는 추세이고 2025년에는 전세계적으로 당뇨병 환자가 약 3억 2천 4백만 명에 이를 것으로 추산하고 있으며 전 인구에 유병율이 8% 이상이며 특히 노인환자에서는 유병율이 크게 증가하고 있다. 이에 따라 세계 당뇨관련 시장은 연평균 12.5%의 성장률로 성장하여 2005년 182억 달러에서 2015년 602억 달러의 시장을 형성할 것으로 전망. 국내의 경우 연평균 12.5%의 성장률로 성장하여 2005년 1,229억 원에서 2015년 4,218억 원의 시장을 형성할 것으로 전망하고 있다. 기존 당뇨병 약제의 경우 약물에 따라, 저혈당, 심장손상, 간손상, 복통, 식욕부진, 체중증가 및 장내 가스 발생 등 심각한 부작용이 나타날 수 있으며, 복용기간이 지속되면 약물의 효능이 감소될 수 있어 시간이 지남에 따라 약물의 종류를 바꾸거나 복용량을 변화시키는 등 많은 문제점을 가지고 있다.
따라서 부작용이 없고 우수한 효과를 나타내는 당뇨병의 예방 치료물질로서 천연물 유래 소재의 발굴에 대한 연구가 절실하다. 해양생물자원 중 해조류 유래의 다양한 천연물들은 그 구조와 생리활성도의 특이성 면에서 질병 예방 및 치료제 개발을 위한 강력한 신물질의 보고로 떠오르고 있다. 따라서 해조류에 관한 연구는 급속도로 증가하고 있으며 생화학, 의∙약학 등의 기초 및 응용연구에도 많이 활용되고 있다. 또한 강력하고 특이한 생리활성을 가진 상당수의 해조류는 의약품, 기능성식품 및 화장품 등으로 개발 및 산업화에 성공하여 새로운 기능성 소재를 탐색하는 분야에서 해조류는 무한한 가능성을 가지고 있다. 이러한 점에서 우리나라의 해양생물 분포 상 중요한 위치를 차지하는 제주 연안의 해조류를 이용하여 항당뇨 소재로서의 활용은 경제 산업적 측면에서 체계적으로 연구할 가치가 있다고 생각된다. 따라서 이 연구에서는 제주연안에 서식하고 있는 갈조류를 대상으로 항당뇨성 물질을 분리하고 기능성 식의약품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다.
제주연안에 서식하고 있는 17종의 갈조류를 대상으로 α-glucosidase 저해활성 및 근육세포에서의 포도당 흡수촉진 효과를 스크리닝한 결과 넓패 (Ishige sinicola), 부챗말 (Padina arborescens), 큰톱니모자반 (Sargassum serratifolium) 그리고 큰잎모자반 (Sargassum coreanum)에서 다른 갈조류에 비해 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였고, raw materials 확보와 식용가능여부 등을 고려하여 넓패를 대상으로 활성물질을 분리하였다. 그 결과 phlorotannin계열의 octaphlorethol A (OPA)이라는 잠재적인 항당뇨성 물질을 분리하였다.
분리된 항당뇨성 물질인 OPA의 장내 탄수화물 가수분해 효소인 α-glucosidase와 α-amylase저해 활성을 측정한 결과 시판되는 식후 혈당강하제인 acarbose보다 우수한 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였고 in vivo 실험을 통한 식후 혈당강하 및 내당능 test에서도 우수한 혈당 강하 효과를 나타냈다. 또한 제 2형 당뇨동물 모델에서도 혈당강하효과 및 인슐린 저항성 개선 작용을 나타냈다. 식후 혈당강하 효과와 더불어 내당능 및 인슐린 저항성개선 효과를 나타냄에 따라 그 작용기전을 구명하기 위해 근육세포에서 포도당 흡수 촉진 효과를 측정하였다. 그 결과 인슐린과 유사한 포도당 흡수 촉진 효과를 나타냈다. 세포 내 포도당 흡수는 insulin dependent pathway와 insulin independent pathway로 이루어진다. Insulin dependent pathway에 있어서 대표적인 단백질인 Akt는 insulin에 의해 활성화 되며, insulin independent한 pathway에 있어서 핵심 단백질이 AMPK로 알려져 있다. 활성화된 Akt와 AMPK는 포도당수송운반체인 GLUT4의 translocation을 통해 세포 내로 포도당이 흡수된다. OPA에 의한 포도당 흡수 촉진 효과가 어떠한 pathway로 이루어지는 지 Western blot를 통해 살펴본 결과 OPA는 Akt와 AMPK을 모두 활성화 시켰으며 이에 따라 GLUT4가 세포막으로 translocation되어 포도당이 흡수효과가 나타나는 것을 구명하였다.
췌장 베타세포는 인슐린을 분비하는 세포로서 산화적 스트레스나 염증 등과 같은 자극에 의해 세포 손상을 받게 되면 인슐린 분비능이 감소되어 혈당이 상승하게 된다. Streptozotocin으로 유도된 췌장 베타세포의 손상을 OPA가 보호하는지를 in vitro와 in vivo 상에서 살펴본 결과 streptozotocin 처리한 구에서는 세포 생존률 감소, 세포 내 ROS 증가, DNA 손상과 apoptosis가 증가한 반면 OPA를 처리하였을 때 산화적 스트레스와 apoptosis을 억제하여 세포 생존률 증가 및 우수한 세포 보호효과를 나타냈으며, 인슐린 분비능 또한 상당히 개선시켰음을 확인하였다.
이 모든 결과를 종합해 볼 때, 넓패에서 분리한 OPA는 다양하고 우수한 항당뇨 활성을 가지고 있음을 확인하였으며 그에 따라 OPA는 항당뇨성 물질로서 잠재적인 기능성 식품 및 천연의약 소재로서 충분한 가능성이 있으리라 판단된다.
Anti-diabetic activities of 17 species of the brown algae collected from Jeju Island area were measured by α-glucosidase inhibitory and glucose uptake. Avariety of methanol extracts of brown algae showed anti-diabetic activity. Among them, Ishige sinicola, Padina arborescens, Sargassum serratifolium and Sargassum coreanum extracts exhibited strong activities both α-glucosidase inhibitory and glucose uptake. For the development of functional food and medical drug materials, reflecting on edibility and collection of raw materials, we selected I. sinicola. Therefore, further experiment used I. sinicola. Ethyl acetate (EtOAc) fractions of I. sinicola extracts showed higher anti-diabetic activities than the other organic solvent fractions. Therefore, the fractions of I. sinicola extracts were selected for use in further isolation octaphlorethol A (OPA). OPA was isolated from the methanolic extract from I. sinicola. This structure was elucidated based on NMR spectroscopic data.

This study was designed to investigate whether octaphlorethol A (OPA) may inhibit α-glucosidase and α-amylase activities, and alleviate hyperglycemia in diabetic mice. OPA isolated from Ishige sinicola, a brown algae, evidenced prominent inhibitory effect against α-glucosidase and α-amylase. The IC50 values of OPA against α-glucosidase and α-amylase were 0.11 and 0.34 mg/ml, respectively, which evidenced the higher activities than that of acarbose. The increase of postprandial blood glucose levels were significantly suppressed in the OPA administered group than those in the streptozotocin-induced diabetic or normal mice. Also, the area under curve (AUC) was significantly reduced via OPA administration (907 versus 1034 mg∙h/dl) in the diabetic mice as well as it delays absorption of dietary carbohydrates. Moreover, an intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was evaluated to determine the effects of OPA administration on glucose tolerance. In that result, the blood glucose levels of the OPA administered mice was significantly lower than the control group and it was almost similar to that of metformin administered mice. Finally, the anti-diabetic effects of OPA was investigated in C57BL/KsJ-db/db (db/db), type 2 diabetic mice. The administration of OPA significantly lowered the blood glucose levels and plasma insulin levels compared to the control db/db mice. These results suggest that OPA might be developed into medicinal preparations, nutraceuticals, or functional foods for diabetes, and may also be applied in other therapeutic fields.

In the present study, we reported the glucose uptake effects of octaphlorethol A (OPA) isolated from Ishige sinicola, on skeletal muscle cells. OPA dose-dependently increased glucose uptake in differentiated L6 rat myoblast cells compared to control. Inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) by wortmannin pretreating the cells with wortmannin potently reduced OPA-stimulated glucose uptake, also inhibition of AMP-activated protein kinase (AMPK) by compound C exhibited significant inhibitory effect on OPA-mediated glucose uptake. Western blotting analyses revealed that OPA increased the phosphorylation level of Akt and AMPK and such enhancement can be specifically inhibited by wortmannin and compound C. In addition, we demonstrated that glucose transporter GLUT4 translocation to plasma membrane was increased by OPA. In summary, PI3K/Akt and AMPK activation was involved in the effects of OPA on glucose transport activation and insulin sensitivity. OPA can be further developed as potential compound for the anti-diabetic therapy.

Pancreatic β cells are very sensitive to oxidative stress and this might play an important role in β cell death in diabetes. The protective effect of octaphlorethol A (OPA), one of phlorotannin polyphenol compounds purified from Ishige sinicola (I. sinicola) against streptozotocin (STZ)-induced pancreatic β cells damage was investigated using RINm5F pancreatic β cells and STZ-induced diabetes. Pretreatment of OPA increased the viability of STZ-treated RINm5F pancreatic β cells at concentration 12.5 or 50 μg/ml. Furthermore, pretreatment with OPA dose-dependently reduced thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), intracellular reactive oxygen species (ROS) generation and DNA damage in STZ treated RINm5F pancreatic β cells. Also, OPA pretreatment increased activities of antioxidant enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-px) in STZ treated RINm5F pancreatic β cells. In addition, OPA inhibited the STZ-induced apoptosis, which is detected using flow cytometry and western blot assays. Moreover, OPA pretreatment improved the secretory responsiveness following stimulation with glucose. These results indicate that OPA protects against STZ-induced pancreatic β cells damage via reducing ROS-induced oxidative stress and apoptosis. Additionally, the protective effect of OPA was further demonstrated by restoration of pancreatic β cells damage in STZ-induced diabetic mice. The protective effects of OPA in STZ-induced diabetic mice were essentially the same as those observed when RINm5F cells were used. The diabetogenic effects of STZ were completely prevented when mice were pretreated with OPA. The anti-diabetogenic effects of OPA were also mediated by reducing of oxidative stress and apoptosis. Collectively, these results indicate that OPA may have therapeutic value in preventing β cells damage.
Author(s)
이승홍
Issued Date
2011
Awarded Date
2011. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000005570
Alternative Author(s)
Lee, Seung-Hong
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 생명공학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
국문초록 vi
LIST OF FIGURES x
LIST OF TABLES xvii

INTRODUCTION 1

Part Ⅰ. Screening of α-glucosidase inhibitory and glucose uptake effects of brown seaweeds and isolation of potential anti-diabetic compounds

ABSTRACT 15
MATERIALS AND METHODS 16
General experimental procedures 16
Materials 16
Extraction procedure of 80% methanolic extracts from brown algae17
Inhibition assay for α-glucosidase activity17
Cell culture 19
Glucose uptake assay 19
Extraction and isolation of octaphlorethol A (OPA20
Statistical analysis 20
RESULTS AND DISCUSSIONS 22

Part Ⅱ. Octaphlorethol A isolated from Ishige sinicola inhibits α-glucosidase and α-amylase in vitro and alleviates hyperglycemia in diabetic mice

ABSTRACT 36
MATERIALS AND METHODS 38
Materials 38
Inhibitory effect of OPA on α-glucosidase and α-amylase in vitro 38
Experimental animals 39
Measurement of postprandial blood glucose level 39
Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) 40
Type 2 diabetic mice and experimental design 40
Statistical analysis 41
RESULTS 42
DISCUSSIONS 51

Part Ⅲ. Octaphlorethol A isolated from Ishige sinicola stimulates glucose uptake in skeletal muscle cells by activating Akt and AMPK pathway

ABSTRACT 57
MATERIALS AND METHODS 59
Materials 59
Cell culture 59
MTT assay 60
LDH Cytotoxicity Assay 60
Glucose uptake assay 61
Western blot analysis 61
Plasma membrane fractionation and immunoblot analysis 62
Statistical analysis 63
RESULTS 64
DISCUSSIONS 74

Part Ⅳ. Octaphlorethol A isolated from Ishige sinicola prevents and protects against STZ-induced pancreatic β-cells damage in in vitro and in vivo

ABSTRACT 81
MATERIALS AND METHODS 83
Materials 83
Cell culture 83
Assay of cell viability 83
Assay of lipid peroxidation 84
Assay of intracellular ROS levels and Image analysis 84
Comet assay 85
Antioxidant enzyme assays 86
Cell cycle analysis 87
Nuclear staining with Hoechst 33342 88
Western blot analysis 88
Glucose stimulated insulin secretion (GSIS) 89
Animals and experimental design 90

Measurement of blood glucose, plasma insulin, lipid peroxidation 91
Assay of antioxidant enzymes and immunoblotting93
Statistical analysis 93
RESULTS 94
DISCUSSIONS 116

REFERENCES 123

ACKNOWLEDGEMENT 139
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
이승홍. (2011). Development of Functional Food and Medical Drug Materials Using Antidiabetic Compounds Isolated from Brown Seaweeds
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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