Study on Dietary Essential Amino Acid Requirements by Dipeptides for Marine Fishes

Abstract

어류에서 어체 건조중량의 50~60%는 단백질로 구성되어 있다. 육상 가축동물의 경우 주 에너지원으로 탄수화물을 이용하는 반면, 대부분의 양식어류는 탄수화물 이용률이 극히 낮고 상대적으로 단백질의 이용률이 매우 높아 사료 내 단백질 요구량이 육상 가축동물과 비교하여 2~2.5배 가량 높다. 사료의 부적합한 단백질함량 및 아미노산 조성은 어류의 성장을 감소시키거나 사료비용을 증가시키는 결과를 초래한다. 단백질은 어류 사료에 있어서 고려하여야 할 가장 중요한 요소로써 이러한 단백질을 구성하는 각 아미노산의 조성 및 각 요구량 설정은 양식어류의 성장 및 배합사료 비용과 직접적으로 관계된다.

어류의 초기 발달 단계에서 사료로 공급되어지는 아미노산은 조직 단백질과 고분자 화합물의 합성 및 에너지원으로서 중요하게 작용한다 (Terjesen et al., 1997; Wright and Fyhn, 2001; Finn et al., 2002; Ronnestad et al., 2003). 경골어류에 있어서 사료로 공급된 아미노산의 흡수는 단백질의 가수분해에 의한 peptides (mono-, di-peptides) 형태 또는 직접적인 free 아미노산 형태로 이루어진다. Dabrowski et al. (2003) 연구에서 무지개송어를 대상으로 dipeptide 및 free 형태의 이용성을 비교한 결과 dipeptide를 기초로 한 사료가 높은 성장률을 보였고, free 형태를 기초로 한 사료에서는 낮은 성장률을 보였다. 또한 intact protein 및 free 아미노산을 기초로 한 사료로 methionine 연구에서도 free 아미노산 그룹에서 유의적으로 낮은 성장률을 보였다. Free 형태의 아미노산이 dipeptide, intact protein 및 protein-bound amino acids 보다 이용성이 떨어진다는 연구결과들이 최근 많이 발표되고 있다. 그 매커니즘으로 free 형태의 아미노산은 intact protein 보다 빨리 흡수 및 대사가 되어 이용되기 때문에 비효율적이라고 보고되고 있다. 다른 매커니즘으로는 free 형태의 아미노산이 물에서 보다 더 빨리 침출되어 손실되기 때문이라고 보고되고 있다(Zarate and Lovell, 1997). 따라서 free 아미노산의 이용성을 높이기 위해 microencapsulation 및 coating 기술이 개발되어 영양소의 흡수 및 손실을 막기위해 널리 사용되고 있다.

따라서 기존의 어류 사료 내 아미노산 요구량에 관한 연구가 모두 free 아미노산을 사용하여 도출된 결과이고, 설정된 모든 아미노산 요구량 값이 과대평가 된 결과라는 것이 본 연구의 가설이다. 이러한 가설에 착안하여 본 연구는 해산양식 어종인 넙치, 감성돔, 참돔을 대상으로 사료 내 필수아미노산인 루신(leucine)을 free형태와 dipeptide형태로 각각 첨가하여 성장을 비교하였으며, 더 나아가 각각의 형태에 따른 요구량을 비교하여 적정요구량 및 가설을 입증하기 위해 수행되었다.

위에서 언급한 가설을 입증하기 위해 5번의 사양실험을 수행하였으며, 사양실험1(Chapter two)은 참돔을 대상으로 루신(Leucine)을 각각 free와 dipeptide 형태로 첨가(0.7%, 1.4%)하여 비교하였으며, 사양실험2(Chapter three)는 참돔을 대상으로 페닐알라닌(Phenylalanine)을 각각 free와 dipeptide 형태로 첨가(0.7%, 1.4%)하여 이용성 및 성장을 비교하였다. 사양실험3(Chapter four)은 감성돔을 대상으로 각각 free 및 dipeptide 형태로 leucine을 단계별로 첨가(C-0.4%, D-0.7%, D-1.0%, D-1.3% 및 F-0.7%, F-1.0%, F-1.3%)하여 사료 내 적정 요구량을 비교하여 규명하였으며, 사양실험4(Chapter five)는 넙치를 대상으로 각각 free 및 dipeptide 형태로 사료 내 단계별로 첨가(C-0.6%, D-0.9%, D-1.2%, D-1.5% 및 F-0.9%, F-1.2%, F-1.5%)하여 아미노산의 이용성 및 적정 요구량을 규명하였다. 사양실험5(Chapter six)는 넙치를 대상으로 추후 비교연구를 위해 우선적으로 free형태의 phenylalanine을 사료 내 단계적으로 첨가(P-0.4%, P-0.7%, P-1.0%, P-1.3%, P-1.6%, P-1.9%)하여 필수성 및 적정요구량을 규명하였다.

사양실험1의 결과, dipeptide 형태로 루신(leucine)을 첨가한 실험구가 free 형태로 루신을 첨가한 그룹과 비교하여 유의적으로 높은 성장률을 보였다. 일간성장률에서도 dipeptide 그룹에서 free 그룹보다 유의적으로 높은 결과를 보였다. 사료효율에서는 dipeptide 형태로 루신을 첨가한 1.4% 그룹(D-1.4)에서 다른 그룹보다 유의적으로 높은 효율을 보였다. 단백질전환효율 역시 사료전환효율결과와 비슷하게 D-1.4 그룹에서 다른 그룹보다 유의적으로 높은 효율을 보였다. 이 결과는 본 연구의 가설인 기존의 아미노산 요구량이 과대평가되어 도출된 결과라는 것을 확실히 증명하는 결과이다. 이러한 연구결과를 바탕으로 사양실험2에서는 필수아미노산 중 하나인 페닐알라닌 (Phenylalanine)을 dipeptide 형태와 free 형태로 첨가하여 참돔을 대상으로 성장실험을 수행하였다. 그 결과, 성장률, 사료섭취율, 일간성장률, 사료전환효율, 단백질전환효율 및 생존율에 있어서 모든 실험구간에 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다. 하지만 전어체의 구성아미노산 분석결과에서 0.7%를 첨가한 그룹에서 dipeptide와 free 그룹을 비교한 결과 dipeptide 그룹이 free 그룹 보다 모든 아미노산 함량이 높았다. 하지만 1.4%를 첨가한 그룹에서는 모든 아미노산의 함량에서 dipeptide와 free 그룹간에 아무런 차이를 보이지 않았다. 이 결과는 아마도 참돔의 페닐알라닌 요구량이 0.7% 이하이거나, 다이펩타이드의 결합에 의한 차이로 판단된다. 따라서 사양실험3은 dipeptide와 free 형태의 루신을 사료 내 단계별로 첨가하여 넙치치어를 대상으로 아미노산 형태에 따른 요구량을 비교하기 위해 수행하였다. 그 결과, dipeptide 그룹에서 보다 높은 성장률을 보였으며, 아미노산의 이용률도 높았다. 사료 내 루신의 적정요구량은 free 형태일 때 1.00%, dipeptide 형태일 때 0.88%로, dipeptide 형태의 루신으로 했을 때 적정요구량이 약 0.12% 낮게 분석되었다. 이러한 결과들을 바탕으로 사양실험4는 다른 어종에서는 어떠한 결과를 보이는 알아보기 위해 dipeptide와 free 형태의 루신을 사료 내 단계별로 첨가하여 감성돔 치어를 대상으로 아미노산 형태에 따른 요구량을 비교하기 위해 수행하였다. 그 결과, 사양실험 3의 결과와 유사하게 dipeptide 그룹에서 보다 free 그룹 보다 높은 성장률을 보였으며, 아미노산의 이용률도 높았다. 사료 내 루신의 적정요구량은 free 형태일 때 1.09%, dipeptide 형태일 때 0.99%로, dipeptide 형태의 루신으로 했을 때 적정요구량이 약 0.1% 낮게 분석되었다. 사양실험5는 추후 dipeptide로 도출된 요구량과 비교하기 위해 우선적으로 free 형태의 페닐알라닌(Phenylalanine)을 사료 내 단계별로 첨가하여 넙치치어를 대상으로 수행되었다. 그 결과, 사료 내 페닐알라닌의 함량이 증가함에 따라 성장률이 유의적으로 증가하다가 적정요구량을 넘으면 오히려 감소하는 경향을 보였다. 사료 내 페닐알라닌의 적정요구량은 0.9%로 판단되며, 본 연구결과는 추후 dipeptide 연구결과를 참고하여 보다 더 정확한 요구량이 규명될 것이다.

위 결과들을 종합해 볼 때, 해산어류(넙치, 참돔, 감성돔)는 free 아미노산 보다 dipeptdie형태의 아미노산을 보다 효율적으로 이용하여 성장률을 높일 수 있을 것으로 판단된다. Dipeptide는 해산어류의 아미노산 요구량 연구에 있어서 free 형태의 아미노산을 대체하여 보다 더 정확한 요구량을 알아보기 위한 아미노산 원료로 사용 가능할 것으로 판단된다. 본 연구결과를 비추어 보아 지금까지 보고된 기존의 아미노산 요구량결과는 과대평가될 수 있다는 본 연구의 가설이 확실히 증명되었으며, 이러한 결과들을 바탕으로 하였을 때 넙치에 있어서 배합사료 내 루신의 적정첨가 함량은 0.88%, 감성돔에 있어서 루신의 적정첨가 함량은 0.99%로 판단된다. 또한 나머지 필수아미노산에 대해서도 본 연구의 모델을 기초하여 요구량을 재평가하고 확립하여야 할 것으로 판단된다.

The purposes of this dissettation are to (1) study the utilization of dietary amino acids (different forms of amino acids) in marine fishes during early life stages (larvae and juvenile), (2) to determine the optimum dietary essential amino acids requirements in marine fishes by free or dipeptide forms of amino acids in terms of their growth performance and concentration of whole-body amino acids.

Most microorganisms and plants can synthesize all 20 primary amino acids, while animals should obtain some of the amino acids (AAs) from their diet. It has been reported that fish require the same ten indispensable amino acids as other animals for growth (Wilson et al., 1980). The quantitative essential amino acid (EAA) requirements of various fish species have long been studied to attain the optimum growth and feed utilization, cost-effective diet formulation, and desirable carcass quality. However, dietary EAA requirements have been quantified for a few number of fish raised in Aquaculture (NRC, 1993).

Experiment 1 (Chapter 2) is about the utilization efficiency of dipeptide and free forms of leucine in the diets of juvenile red seabream. This study was conducted to investigate the utilization of the amino acid, figure out the optimum dietary leucine level, and to compare the growth performance by dipeptdie and free forms of leucine. Juvenile red seabream (BW: 1.21 g) were fed one of four experimental diets for 6 weeks which were formulated to contain 45% crude protein with two levels of leucine levels of 0.7 and 1.4% by different forms of leucine (free and dipeptide, L-leucine or Leu-Gly) (designated as D-0.7, D-1.4, F-0.7 and F-1.4, respectively). At the end of the feeding trial, the fish fed the leucine in dipeptide form (Leu-Gly) had significantly higher weight gain at all the two dietary leucine levels (0.7, and 1.4%) than the fish fed free form, L-leucine. All the essential and non essential amino acid levels in whole-body were significantly higher in dipeptide groups than free groups at 0.7 and 1.4% dietary leucine levels. Results from the feeding trials clearly demonstrated that AA requirement using free AAs in fish may have been over-estimated in most previous studies. Dieptdies can be used as promising AA source for AA requirement study in fish. The present study indicates that juvenile red seabream requires approximately 0.7-1.4% dietary leucine for optimum growth performance.

Experiment 2 (Chapter 3) is about the utilization of dipeptide and free forms of phenylalanine in diets of juvenile red seabream. This study was conducted to evaluate the efficacy of dipeptide form of phenylalanine as a new source of amino acid in terms of growth performance and whole-body amino acid composition in comparison to free form for red seabream (Pagrus major). Fish (1.46±0.001 g) were fed four isonitrogenous and isocaloric experimental diets containing 0.7 or 1.4% phenylalanine either in free or dipeptide form. A feeding trial was carried out in three replicates and the fish were fed to apparent satiation for six weeks. At the end of the experiment all the fish in each tank were counted and weighed for evaluation of survival and growth performances, sampled for whole body amino acid composition analysis. The results showed that growth performance and survivals of red seabream were not significantly affected by the changes in phenylalanine form or inclusion level. Whole-body amino acid compositions revealed no significant changes in concentrations of both essential and non-essential amino acids regardless of the increase in phenylalanine levels or the use of its different forms. The finding in this study indicates that juvenile red seabream can utilize dipeptide phenylalanine as efficiently as free form without any undesirable effects on growth performance or whole body amino acid composition.

Experiment 3 (Chapter 4) focuses on comparison of leucine requirements in black seabream (Acanthopagrus schlegeli) by free and dipeptide forms of leucine. A four-week feeding trial was carried out to provide an innovative experimental model with different forms of leucine (free or dipeptide) for black seabream, and to re-evaluate the previous results on dietary requirement ofleucine. Triplicate groups of fish (average weight, 3.23± 0.03 g) were fed seven isonitrogenous and isocaloric experimental diets containing 0.4, 0.7, 1.0 and 1.3% leucine in either free or dipeptide form (designated as C-0.4, D-0.7, D-1.0, D-1.3, F-0.7, F-1.0 and F-1.3, respectively). After four weeks of feeding trial, the fish fed the diets supplemented with dipeptide leucine showed significantly higher growth performance than the fish fed free leucine. Whole-body protein levels increased with increasing dietary leucine level. The concentrations of leucine and taurine in the whole-body increased with increasing dietary leucine level. However, the concentrations of isoleucine, lysine and valine in the whole-body decreased with increasing dietary leucine level. The requirements of leucine in diets for the fish were estimated at 1.09 or 0.99% based on broken-line regression analysis for free or dipeptide leucine, respectively. The results clearly demonstrated that the AA requirement using free AAs in fish may have been over-estimated in most previous studies. Dipeptides can be used as promising AA source for AA requirement study in fish. This study indicates that juvenile black seabream requires 0.99% dietary leucine for optimum growth performance.

Experiment 4 (Chapter 5) focuses on the comparison of leucine requirements in olive flounder (Paralichthys olivaceus) by free and dipeptide forms of leucine. We report a promising solution to solve the overestimated essential amino acid (AA) requirements in culture of fish species. An eight-week feeding trial was carried out to provide an innovative experimental model with different forms of leucine (free or dipeptide) and to re-evaluate the previous results on dietary requirements of essential AAs. Triplicate groups of olive flounder at the early stages (average weight, 0.27± 0.001 g) were fed seven isonitrogenous and isocaloric experimental diets containing 0.6, 0.9, 1.2 and 1.5% leucine in either free or dipeptide form (designated as C-0.6, D-0.9, D-1.2, D-1.5, F-0.9, F-1.2 and F-1.5, respectively). After eight weeks of the feeding trial, the fish fed the diets supplemented with dipeptide leucine showed significantly higher growth performance than the fish fed free leucine. Whole-body AA concentrations and survival rate were significantly higher in the fish fed dipeptide leucine than the fish fed the basal diet without leucine supplementation. The requirements of leucine in diets for the fish were estimated at 1.00 or 0.88% (2.27 or 2.00% of dietary protein) based on broken-line regression analysis for free or dipeptide leucine, respectively. The results demonstrated that the AA requirement using free AAs in fish may have been over-estimated in most previous studies. AAs are more available to the fish when AAs are provided in dipeptide rather than free forms. Dipeptides can be used as promising AA source for AA requirement study in fish. The dietary leucine requirement is suggested to be 0.88% (2.00% of dietary protein) for optimum growth performance of olive flounder.

Experiment 5 (Chapter 6) focuses on the optimum dietary phenylalanine requirement in juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus) by free form of phenylalanine. This study was conducted to determine the optimum dietary phenylalanine requirements for the optimum growth of juvenile (initial weight, 0.81 ± 0.02g) olive flounder. Six semi-purified diets were formulated to contain 45% crude protein with six graded levels of phenylalanine levels of 0.4, 0.7, 1.0, 1.3, 1.6 and 1.9% (designated as P-0.4, P-0.7, P-1.0, P-1.3, P-1.6 and P-1.9, respectively). Each diet was fed to triplicate groups of fish in a flow-through system for 6 weeks. At the end of the feeding trial, growth of the fish fed the P-1.0 diet was not significantly different from that of the fish fed 0.7, 1.3, 1.6 or 1.9% dietary phenylalanine, but it was significantly higher than that of the fish fed the 0.4% diet. No improved growth performance was observed beyond 1.0% dietary phenylalanine levels (1.3-1.6%). The requirement of leucine in diets for the fish was estimated at 0.8% based on broken-line regression analysis.

The results from this stdy clearly demonstrated the hypothesis that the amino acid requirements in fish might have been over-estimated in most previous studies. The availability of amino acids could be better in fish when they are fed with dipeptides forms rather than free forms. Dipeptides can be used as promising AA source for AA requirement study in fish. Therefore, it is assumed that an accurate amino acids requirement could be estimated by a "New experimental model for amino acids requirement" from this study. It is also suggested from this study that the requirement of other essential amino acids should be re-evaluated based on this model.