Development of loop-mediated isothermal amplification technique and trivalent vaccine for olive flounder against streptococcusis and edwardsiellosis

Abstract

우리나라의 넙치양식은 해산어류양식에서 가장 큰 비중을 차지하고 있으며 가장 널리 보급되어 경제적 가치가 증가하고 있으며 특히 제주도의 경우 전국의 양식넙치 생산량의 약 50%를 생산하고 있다. 현재 넙치양식을 포함한 어류양식산업은 고밀도의 사육으로 인한 바이러스, 세균, 진균, 기생충성 질병이 만연하여 있으며 이는 어류양식산업의 가장 큰 문제점 중 하나이다. 특히 넙치양식에서 이러한 질병 중 세균성 질병에 인한 대량폐사가 끊임없이 일어나 많은 경제적인 손실을 초래한 바 있다. 이러한 세균성 질병에 대처하기 위해 많은 양식어민들은 유사한 질병증후가 발생하거나 예방차원에서 과도한 화학요법제를 사용하고 있다. 화학요법제의 과도한 의존은 지난 수년 동안 지속적으로 행하여져 왔으며 이에 따른 항생제 내성 균주 발생, 양식장 주변의 환경오염등의 사회적 문제가 대두되고 있으며 이를 해결하고자 하는 학계, 기관, 양식어민들의 자성의 목소리가 커지고 있는 상황이다. 따라서 이러한 문제점의 효과적인 해결책으로는 정확한 어류질병의 진단, 항생제를 대처할 수 있는 예방적 방안 중 최선책이라고 할 수 있는 효과적인 백신의 개발이라고 생각된다. 따라서 본 연구에서는 이 두가지 측면으로 연구를 진행하여 양식어민의 화학요법제에 대한 의존도를 낮추고자 하였다. 따라서 양식넙치의 주요 세균성 질병인 연쇄구균증 및 에드워드증의 원인균인 S. iniae, S. parauberis, E. tarda를 제주도의 넙치양식장의 위의 세균성 질병에 감염된 증상을 보이는 감염어에서 61개의 wild-type 균주를 분리하여 실험에 사용하였다. 분리된 균주들 중 연쇄구균의 경우 비운동성의 그람양성구균임을 확인하였으며 catalase 및 oxidase 활성의 경우 음성임을 확인하였다. 에드워드 균주의 경우 운동성을 보였으며 그람음성 단간균임을 확인하였고 내염성특성 및 indole, H2S의 생산성을 보였다. 특히 S. iniae 균주들은 모두 β-용혈성을 보인 반면 S. parauberis 의 경우 α-용혈성을 보였다. 분리균주들은 API 20 strep 및 API 20 E를 통해 생화학적 특성을 확인하였으며 그 결과 표준균주와 매우 유사한 특성을 보였으며 차 후 백신제조를 위한 Phenotyping의 기반으로 이용하였으며 S. iniae의 경우 6가지의 phenotype, S. parauberis의 경우 7가지의 phenotype, E. tarda의 경우 3가지의 phenotype으로 나눌 수 있었다. 모든 분리균주들은 기존에 연구발표된 multiplex PCR을 통하여 동정하였으며 사용된 프라이머는 Spa-2152, Spa-2870, LOX-1, LOX-2, EDtT, EDtA를 사용하였다. Multiplex PCR 결과 양성반응의 경우 선명한 단일 밴드를 확인할 수 있었고 S. iniae, S. parauberis, E. tarda의 경우 각각 870, 718, 268 bp의 증폭산물을 얻을 수 있었다. 추가적으로 분리균주들은 16S rRNA 염기서열을 기반으로 BLAST 분석을 실시한 결과 각각의 보고된 type strain의 염기서열과 99%이상의 상동성을 보였으며 최종적으로 S. iniae 8균주, S. parauberis 48 균주, E. tarda 5균주를 본 연구에 사용하였다. 이들의 백신개발 및 효율적인 분자진단법을 개발하기 위해 RAPD를 이용하여 genotyping을 하였으며 6가지의 random primer를 사용하였다. 분리균주들의 RAPD fingerprint 결과 S. iniae의 경우 3가지의 genotype, S. parauberis의 경우 8 가지의 genotype, E. tarda의 경우 2가지의 genotype으로 genotyping 하였으며 이러한 결과를 위에서 조사한 phenotype 패턴과 종합하여 백신개발을 위한 후보균주를 각각 3 균주씩 선발하였다. 선발된 균주의 넙치에 대한 병원성을 검증하기 위하여 복강주사 및 침지를 통해 감염실험을 실시하였으며 그 결과 가장 병원성이 높았던 S. iniae JJU-019, S. parauberis JJU-045, E. tarda JJU-054를 백신제조에 사용하였다. 특히 S. iniae와 E. tarda의 경우 균주별로 병원성의 차이가 크지 않았던 반면 S. parauberis의 경우 균주별 병원성의 차이가 매우 크게 나타났다. 또한 복강주사를 통한 감염실험에 비해 침지감염의 경우 E. tarda를 제외하고 만족할 만한 폐사를 확인할 수 없어 본 연구에서는 복강주사를 통한 방법이 보다 더 적합하다고 사료된다. 앞서 언급한 두가지 측면 중 효율적인 분자진단 기법의 개발의 경우 일반적인 PCR 기법이 가지고 있는 근본적인 문제점인 높은 소요비용을 해결하는 것이 가장 중요하다고 생각한다. 비록 전통적인 진단법에 비해 PCR 기반 진단법이 매우 정확한 진단을 할 수 있는 장점을 지녔지만 고가의 PCR 증폭기기가 필수적이기 때문에 양식어민이 직접 시행하기 불가능 한 실정이며, 비록 국가기관 연구소에서 어류질병진단 서비스를 시행하고 있다고 하더라도 수많은 양식장의 민원을 신속하게 처리하기는 어려워 병목현상을 피할 수 없는 처지이다. 따라서 본 연구에서는 양식어민들이 직접 정확한 분자진단을 저렴하게 시행할 수 있을 것으로 보이는 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)이라는 등온증폭법을 적용하고자 하였다. 이는 target gene의 6부위의 서열을 설정하여 2쌍의 inner primer와 2쌍의 outer primer를 이용하여 bst polymerase로 증폭시키는 기법으로서 특히 bst polymerase의 최적 활성온도인 65 °C에서 증폭시키기 때문에 고가의 PCR 증폭기기 없이 항온수조만으로도 시행할 수 있어 진단키트화 하였을 때 양식어민들이 직접 시행할 수 있을 것으로 사료되며 일본에서는 이미 상용화 단계까지 연구되었다는 보고가 있다. 본 연구에서는 실험에 사용된 병원균별로 genbank에 보고된 유전자 중 species 에 따라 보존적이며 다른 species에 상동성이 낮은 서열을 BLAST를 이용하여 선별하였으며 이는 S. iniae의 경우 LctO gene, S. parauberis의 경우 AroK gene, E.tarda의 경우 AroB gene을 이용하여 species-specific 한 LAMP primer를 디자인하였다. 사용된 primer 들이species-specific 한 증폭 여부를 확인하기 위해 RAPD를 통해 조사한 genotype 별로 5가지의 균주를 각각 선발하여 각각의 species-related 한 균주들과 주요 어류병원균의 LAMP 증폭여부를 비교하였다. 그 결과 모든 LAMP primer가 species-specific 한 증폭을 하는 것을 확인하였으며 증폭산물의 전기영동 결과 LAMP 특이적인 사다리 형태의 증폭산물을 확인할 수 있어 사용된 LAMP primer들이 분자진단용 primer로서 이용 가능하다고 사료된다. LAMP의 감도를 측정하기 위해 각각의 균주를 농도별로 단계 희석하여 양식어민이 시행하기 수월할 것으로 사료되는 boiling protocol을 통해 DNA를 추출하여 LAMP 반응을 시켰다. 그 결과 S. iniae의 경우 1.0 × 10-6 CFU/ml의 검출한계를 보였으며 이는 기존의 PCR 기법과 동등한 수준이었다. 하지만 S. parauberis, E. tarda의 경우 각각 1.0 × 10-3 CFU/ml, 1.0 × 10-5 CFU/ml 의 검출한계를 보였으며 기존 PCR 기법의 각각 100배 및 10배의 비교적 높은 검출 한계치를 보여 매우 유용성 있는 진단기법이라 사료된다. 또한 각각의 LAMP primer들은 반응온도, 반응시간, Mg++, betaine, dNTP, bst polymerase 농도에 따른 LAMP 반응의 최적조건을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 연구에서 개발한 LAMP primer는 기존의 분자진단 기법을 개선할 수 있는 방안으로 의의가 있다고 사료된다. 위에서 언급하였던 방안 중 어류질병의 예방적 측면에서 가장 궁극적인 방안이라 할 수 있는 백신의 개발은 복합백신의 측면으로 접근하였다. 어류양식의 병원체에 대한 백신의 경우 국내에서도 많은 연구가 진행되고 있으나 단일백신의 경우 특정병원체에 대한 방어효과만을 얻을 수 있기 때문에 양식어민들이 어류의 스트레스를 우려하여 적극적인 적용을 아직까지 꺼려하고 있어 상용화가 가능한 복합백신 개발이 시급하다. 특히 본 연구에서는 국내에서는 주로 다루지 않았던 oil adjuvant 백신을 개발하여 효과를 검증하였으며 이는 양식어류에 대한 보호효과를 보다 지속적으로 유지할 수 있는 장점이 있다고 알려져 있다. 따라서 양식넙치의 주요 세균성 질병에 대한 복합백신의 유효성을 측정하기 위해 각각의 단일백신 (FO-3, FO-4, FO-5)과 복합백신 (FO-1)의 보호효과 및 혈액분석, 항체응집가, 비특이적 면역반응을 확인하였다. 사용된 백신의 충분한 면역화를 위해 백신 주사 후 28일간 면역화 시켰으며 이는 accumulated temperature를 기반으로 하였고 최소 450 dd에서 충분히 어류를 면역화 시킬 수 있다는 기존의 노하우를 바탕으로 하였고 감염실험을 실시한 시점의 accumulated temperature는 약 660 dd로 충분히 면역화되었다고 사료된다. 백신에 의한 면역화 기간 동안 FO-1의 접종구의 경우 미미한 폐사가 발생하였으며 이는 폐사율이 0.008%였으며 폐사어의 감염증후가 보이지 않아 백신에 의한 폐사가 아닌 것으로 사료되며 나머지 실험구의 경우 면역화 기간동안 폐사가 일어나지 않아 안전성 측면에서 문제점이 없다고 사료된다. 또한 백신접종 후 즉시 사료섭이가 회복되는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 사용된 백신이 어체에 큰 스트레스를 미치지 않는다고 판단된다. 특히 면역화 기간 동안 넙치의 성장도를 조사한 결과 대조구에 비해 유사하거나 10% 가량 성장도가 증가하는 것으로 조사되었다. 백신처리구의 혈액분석을 통해 어체의 건강도를 유추해 보았으며 관련 parameter가 대조구에 비해 유의적인 변화를 보이지 않아 백신접종에 대한 부작용이 없는 것으로 판단된다. 어류의 비특이적 면역기작 중 respiratory burst activity에 관련하여 NBT reduction activity 및 MPO release activity에 대한 실험 결과 대조구에 비해 모든 백신처리구에서 유의적으로 높은 결과치를 보였다. 또한 lysozyme activity의 경우 단일백신인 FO-4 실험구를 제외하고 모든 실험구에서 대조구보다 유의적으로 높은 lysozyme activity을 보였다. 특히 FO-5 처리구에서 높은 lysozyme activity를 보였으며 복합백신 처리구의 경우 백신처리 2주까지 유의적으로 증가되는 양상을 보였으며 백신처리 4주까지 높은 lysozyme activity를 유지하는 것으로 확인되었다. cell-mediated immunity 지표인 phagocytosis activity 의 경우 역시 면역화 기간동안 대조구에 비해 높은 활성을 보였다. 특히 단일백신은 FO-3의 경우 실험구중 가장 높은 활성을 보였으며 복합백신 처리구의 경우 역시 백신처리 2주까지 유의적으로 증가되는 양상을 보였으며 백신처리 4주까지 높은 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 백신에 의한 충분한 항체가 생성되었는지 확인하기 위해 응집항체가를 측정하였으며 S. iniae, S. parauberis의 경우 비교적 낮은 응집항체가를 보였지만 대조구에 비해 높은 응집가를 확인할 수 있었다. 반면에 E. tarda에 대한 응집항체가의 경우 모든 실험구에서 비교적 높은 응집항체가를 보였으며 단일백신 및 복합백신 모두 대조구에 비해 유의적으로 높은 응집항체가를 보였으며 백신접종 2주까지 증가되고 유지되는 양상을 보였다. 따라서 실험에 사용된 단일 백신 및 복합백신 모두 충분한 면역화를 유도한다고 사료된다. 최종적으로 직접적인 병원체에 대한 백신의 어체 보호효과를 확인하기 위해 감염실험을 실시하였으며 병원체의 인위감염농도는 위에서 언급한 병원성 실험을 토대로 설정하였다. 감염실험 결과 S. iniae에 대한 최종적인 폐사율은 대조구가 82.5% 임에 반하여 단일백신 FO-3의 경우 7.5%, 복합백신 FO-1의 경우 2.5%의 폐사율을 보였으며 상대생존율이 각각 96.97%, 90.31%로 나타나 강력한 보호효과를 확인할 수 있었다. S. parauberis에 대한 최종적인 폐사율은 대조구가 65 % 임에 반하여 단일백신 FO-4의 경우 10 %, 복합백신 FO-1의 경우 20 %의 폐사율을 보였으며 상대생존율이 각각 84.62%, 69.23%로 나타났다. 이러한 결과를 통해 사용된 복합백신의 경우 상대생존율이 60% 이상으로 상용화 기준을 상회하는 수준임을 확인할 수 있었다. 반면에 E. tarda에 대한 최종적인 폐사율은 대조구가 85 % 였으며 단일백신 FO-5의 경우 32.5 %, 복합백신 FO-1의 경우 47.5 %의 폐사율을 보였으며 상대생존율이 각각 61.76 %, 44.12 %로 나타났다. 이는 복합백신의 경우 상대생존율이 상용화 기준에 미치지 못하였지만 유의적인 방어효과를 얻었으며 차 후의 항원의 농도를 증가시키는 등의 조치를 통해 충분히 상용화 수준까지 끌어 올릴 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 연구에서 사용된 복합백신 FO-1의 경우 양식넙치의 주요 세균성 질병인 S. iniae, S. parauberis, E. tarda에 대한 충분한 보호효과 및 넙치의 비특이적인 면역반응을 유도하는 것을 알 수 있었으며 차 후에 field test를 거친다면 상용화가 가능하다고 사료된다. 본 연구에서는 양식넙치의 세균성 질병의 효과적인 제어를 위해 두가지 측면으로 접근하였으며 양식어민이 직접 사용 가능한 간편하고 효과적이고 정확성을 갖춘 LAMP primer를 제작하여 충분한 적용가능성을 확인할 수 있었고 양식넙치의 oil adjuvant 기반의 복합백신을 개발하여 지속적이고 다수의 병원체에 대한 보호효과를 얻을 수 있음을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 결과물이 양식어민의 근심을 덜어 줄 수 있는 방안이 될 수 있을 것이라고 사료된다.