흰쥐의 해마 신경세포에서 신경흥분독성에 대한 전압의존적 A-type 포타슘 채널의 반응 특성 연구

Abstract

흥분성 신경전달 물질인 글루탐산은 중추신경계의 정상적인 기능에 중요한 역할을 하지만, 병적 조건하에서 과분비가 일어나면 신경세포를 과흥분시키고 흥분독성을 야기한다. 최근의 연구에서 이와같은 신경세포의 흥분성에 A-type K+ channel의 작용이 중요하다는 사실이 보고되었다. A-type K+ channel은 역치 이상의 전압 영역에서 순간적으로 활성화 후에 빨리 비활성화가 되는 특성을 갖는다. 또한 excitatory postsynaptic potential의 형성에 중요한 역할을 하고, 활동전위의 전파를 제한하고, 수상돌기에서의 활동전위 형성을 막는 등의 작용을 하여 신경세포막 흥분성 조절에 중요한 역할을 한다. 최근의 연구에서 신경세포 외부에 생화학적으로 외인성 글루탐산을 처리한 결과 세포막의 A-type K+ channel의 발현이 감소함을 확인하였으나, 실제 생리적 활동 중인 신경세포에서의 흥분성에 대한 A-type K+ channel의 조절에 대한 증거를 제시하지 못했다는 한계를 갖고 있다. 따라서 본 연구에서는 신경세포의 생리학적 흥분상황 유도를 통해 내인성 glutamate 분비하여 해마 신경세포에서의 흥분성에 대한 A-type K+ channel의 조절작용이 어떻게 나타나는지 확인하였다. 내인성 글루탐산 분비를 유도하기 위해 recording solution(10 mM, 2 min) 또는 cluture media(20 mM, 24 hours)에 고농도의 KCl을 처리하여 A-type K+ current(IA)의 크기 및 기질 변화를 정상 대조군과 비교, 관찰하였다. 내인성 글루탐산 분비를 단시간 또는 장시간 유도한 결과 정상 대조군에 비하여 IA의 크기가 유의하게 감소되었고, 또한 글루탐산 수용체 중 하나인 NMDA 수용체를 APV(100 μM)를 이용하여 차단하였을 때 내인성 글루탐산 효과가 사라짐을 확인하였다. 이는 A-type K+ channel의 발현 조절에 내인성 글루탐산의 분비유도를 통한 NMDA 수용체의 활성화가 중요함을 의미한다. 반면 A-type K+ channel의 기질변화를 확인한 결과 장시간 내인성 글루탐산 분비를 유도한 그룹에서만 inactivation 특성이 과분극 전위 영역으로 이동이 일어남을 확인하였다. 신경세포에는 연접내, 연접외 모두 NMDA 수용체가 존재하고 있고, 많은 연구에서 그 역할이 다르다는 것이 보고되었다. 따라서 외인성 글루탐산을 이용하여 연접내외의 NMDA 수용체의 활성화를 유도하고 A-type K+ channel의 발현에 어떠한 역할을 하는지를 확인하였다. NMDA 수용체의 선택적 차단을 위하여 고농도의 KCl로 연접내에 글루탐산 분비 유도 후 연접내의 NMDA 수용체를 활성화 시키고 활성화된 NMDA 수용체만 차단하는 MK801(25 μM)을 처리하여 연접내의 NMDA 수용체만 선택적으로 차단하였다. 이후 culture media에 외인성 글루탐산(5 μM, 24 hours)을 처리하여 A-type K+ channel의 발현이 어떻게 나타나는지 확인하였다. 그 결과 외인성 글루탐산은 A-type K+ channel의 발현 감소를 일으켰고, 이러한 외인성 글루탐산의 효과는 연접내의 NMDA 수용체를 차단할 때 사라짐을 확인하였다. 이는 A-type K+ channel의 발현조절이 연접내 NMDA 수용체의 활성화를 통해서만 일어남을 의미한다. 연접내는 AMPA 수용체의 존재로 마그네슘 이온에 대한 NMDA 수용체의 차단효과를 제거할 수 있지만 연접외에는 AMPA 수용체의 부재로 NMDA 수용체가 마그네슘에 의해 차단된다. 따라서 연접내의 NMDA 수용체만 선택적으로 차단하고 마그네슘을 제거한 recording solution에 외인성 글루탐산(5 μM, 5 min)을 처리하여 연접외의 NMDA 수용체를 충분히 활성화 시킨 후 A-type K+ channel의 발현량을 확인하였다. 연접외에 존재하는 NMDA 수용체의 선택적 활성화는 A-type K+ channel의 발현에 영향을 주지 못하였고, 이는 A-type K+ channel 채널의 조절에 연접외의 NMDA 수용체 활성화가 영향을 주지 못함을 의미한다. 이상의 결과에서 고농도 KCl을 통한 내인성 글루탐산의 분비유도가 A-type K+ channel의 세포막 발현을 정상 대조군에 비해 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 내인성 글루탐산은 NMDA 수용체의 활성화를 통하여 A-type K+ channel의 발현 조절에 작용함을 확인하였고, 특히 연접내에 존재하는 NMDA 수용체의 활성화를 통해서만 A-type K+ channel의 세포막 발현이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 신경세포의 연접신호전달 특성이 A-type K+ channel을 통해 세포의 흥분성을 조절할 수 있다는 것을 의미한다.

A-type K+(IA) channels are transiently activated in the suprathreshold membrane potential and then rapidly inactivated. These channels shape excitatory postsynaptic potentials, limit the back propagation of action potential, and prevent dendritic action potential initiation. IA channels play roles to control the neuronal excitability in pyramidal neurons in hippocampi. We here tested if regulatory functions of IA channels might be targeted by excitotoxic processings which are accompanied by the abnormal enhancement of synaptic inputs in dissociated hippocampal neurons (DIV 6~8). The application of high KCl in either recording solutions (10 mM, 2 min) or culture media (20 mM, 24 hours) to increase presynaptic glutamate release, significantly reduced the peak of somatic IA with hyperpolarizing-shift of inactivation properties of channels. These changes of IA channels are quietly different from those induced by exogenous glutamate application in either culture media (5 μM, 24 hours) or recording solution (5 μM, 5 min), which can activate both synaptic and extrasynaptic receptors. Glutamate application reduced the somatic IA peak without any kinetic changes of IA channels, indicating that neuronal excitation induced by the enhancement of synaptic transmission may process with distinctive signaling cascades to affect voltage-dependent ion channels in hippocampal neurons. These results suggest that synaptic inputs may determine the somatic membrane excitability by regulating both membrane expression and kinetic properties of IA channels for more efficient correlations between neuronal inputs and outputs. It is also possible that neuronal processings by synaptic inputs are independent on the IA regulations of excitotoxic effects induced by non-specific membrane excitability.