은나노입자에 의한 산화적 스트레스가 세포사멸에 미치는 영향

Abstract

은나노 입자 제품중에서 항균특성을 이용한 제품들이 많은데 이중에서 여러가지 의학용품과 일상용품들을 많이 볼수가 있다. 은나노 입자 제품들이 널리 사용되고 있지만 은나노 입자에 노출 후 세포독성작용에 대한 연구는 아직 적은것으로 알려져 있다. 이 연구는 은나노 입자의 세포독성작용에 관한 분자적 메커니즘을 조사하였다. 우선, 은나노 입자로 인한 세포독성이 은 이온 소스인 질산은과 비교하여 훨씬 높다는 것을 보여주었다. 인간의 정상 간세포인 Chang 세포에서 은나노 입자는 환원형 글루타치온의 억제작용을 통하여 활성산소종을 생성한다. 은나노 입자에 의해 생성되는 활성산소종은 세포내 성분을 손상시키는데 DNA 절단, 지질막 과산화작용, 단백질 카보닐화작용을 유도한다. 은나노 입자에 노출 후 아폽토시스, 예를 들면 아폽토틱 바디의 형성, sub-G1 hypodiploid 세포, DNA 분열 등을 통해 세포 생존율이 감소된다. Bax, Bcl-2 발현의 조절을 통한 은나노 입자로 유도되는 미토콘드리아 의존적인 아폽토틱 경로는 미토콘드리아 막전위의 붕괴를 유도한다. 미토콘드리아 막전위의 손실은 미토콘드리아로부터 cytochrome C를 방출하여 caspase 9와 caspase 3을 활성화시킨다. 은나노 입자의 아폽토틱 작용은 JNK의 활성화 그리고 JNK 억제제인 SP600125와 JNK 타깃 siRNA에 의한 억제를 통해 약화된다. 8-Oxoguanine (8-oxoG)은 활성산소종으로 유도되는 DNA 손상에 민감한 마커이다. 8-Oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1)은 중요한 DNA 수복 효소로서 8-oxoG을 인지하고 절단한다. 은나노 입자로 유도되는 산화적 스트레스가 OGG1에 대한 작용과 은나노 입자에 의한 세포독성 메커니즘을 밝히기 위해 아래 단계 연구를 수행하였다. 은나노 입자가 OGG1 mRNA와 단백질 발현을 감소하여 OGG1 활성을 약화시켜서 8-oxoG 레벨을 증가시킨다. 전사인자인 Nrf2는 중요한 인자로서 OGG1의 조절작용을 유도한다. 은나노 입자는 핵내 Nrf2 발현, 핵내로의 이동, Nrf2의 전사활성을 감소시킨다. ERK와 AKT는 Nrf2의 상위로서 OGG1의 발현을 돕는다. 은나노 입자는 ERK와 AKT 단백질 발현의 활성화 폼을 감소시켜서 Nrf2의 억제작용과 OGG1 발현의 감소를 유도한다. CAT나 GPx와 같은 항산화 효소는 산화적 스트레스로부터 직접적으로 세포를 보호한다고 보고되었다. 마지막 연구는 인간 간세포인 Chang 세포에서 은나노 입자에 의한 세포 내 높은 량의 ROS 레벨에 있어서 항산화제의 역할과 분자적인 메커니즘을 조사하였다. 은나노 입자는 ROS 레벨을 증가시키는 동시에 CAT와 GPx의 발현과 활성, 그리고 세포생존율을 감소하지만 강력한 항산화제인 NAC에 의해 확연하게 ROS 레벨을 감소하고 CAT와 GPx의 활성을 회복시키며 세포사멸을 완화한다. 은나노는 AMP-activated protein kinase (AMPK)-forkhead transcription factor 3 (FOXO3) 경로를 감소시키는데 이는 항산화 효소의 유발을 위한 신호경로이다. AMPK 활성화제인 AICAR는 확연하게 CAT와 GPx의 발현을 회복시키며 ROS 레벨과 세포독성을 감소시키지만 AMPK 억제제인 Compound C는 이와 상반된 변화를 관측하였다. 결론적으로 이 연구는 은나노 입자로 유도되는 세포독성이 산화적 스트레스에 의한 아폽토시스와 세포내 성분의 손상에 의한 것이다. 또 은나노 입자의 노출은 ERK와 AKT의 비활성화 작용을 통하여 Nrf2로 매개되는 OGG1을 하류 조절한다는 것을 증명하였다. 은나노 입자로 유도되는 산화적 세포독성은 적어도 부분적인 원인은 AMPK-FOXO3 경로의 억제작용을 거쳐 항산화 효소의 활성을 감소시킨다는 것을 알려주었다.

Silver nanoparticles (AgNPs) products, which have well-known antimicrobial properties, are extensively used as various medical and general products. Despite the widespread use of AgNPs products, relatively few studies have been undertaken to determine the cytotoxic effects of AgNPs exposure. This study investigates possible molecular mechanisms underlying the cytotoxic effects of AgNPs. Initially, we show that AgNPs-induced cytotoxicity was higher compared to AgNO3, as a silver ion source. AgNPs induced reactive oxygen species (ROS) generation via suppression of reduced glutathione (GSH) in human Chang liver cells. ROS generated by AgNPs resulted in damaged cellular components; DNA breaks, lipid membrane peroxidation, and protein carbonylation. Cell viability after AgNPs exposure was decreased via apoptosis, as shown by formation of apoptotic bodies, sub-G1 hypodiploid cells, and DNA fragmentation. AgNPs induced a mitochondria-dependent apoptotic pathway via the modulation of Bax and Bcl-2 expressions, resulting in the disruption of mitochondrial membrane potential (Δψm). Loss of the Δψm was followed by cytochrome c release from the mitochondria, resulting in the activation of caspase 9 and 3. The apoptotic effect of AgNPs was exerted via the activation of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) and was abrogated by the JNK specific inhibitor, SP600125, and small interfering RNA (siRNA) targeting JNK. 8-Oxoguanine (8-oxoG) is a sensitive marker of ROS-induced DNA damage. 8-Oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1) is an important DNA repair enzyme that recognizes and excises 8-oxoG. The further study was to examine the effect of AgNPs-induced oxidative stress on OGG1 and to elucidate mechanisms underlying AgNPs-induced toxicity. AgNPs decreased OGG1 mRNA and protein expression, resulted in the attenuation of OGG1 activity, further led to increased 8-oxoG levels. The transcription factor NF-E2-related factor 2 (Nrf2) is an important factor in the inducible regulation of OGG1. AgNPs treatment decreased nuclear Nrf2 expression, translocation into nucleus, and transcriptional activity. Extracellular regulated kinase (ERK) and protein kinase B (PKB, AKT), which are upstreams of Nrf2, contribute to OGG1 expression. AgNPs attenuated both active forms of ERK and AKT protein expression, resulting in suppression of Nrf2 and decrease of OGG1 expression. Antioxidant enzymes such as catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) have been reported to directly protect the cells from oxidative stress. The final part of the study is to investigate the roles of antioxidants in the high intracellular levels of ROS induced by AgNPs in human Chang liver cells and the molecular mechanisms involved. AgNPs increased ROS levels, coincided with the decreased expressions and activities of CAT and GPx, and cell survival, but the addition of N-acetylcysteine (NAC), a potent antioxidant, significantly reduced the ROS levels, restored the activities of CAT and GPx, and finally abated cell deaths. AgNPs decreased an AMP-activated protein kinase (AMPK)-forkhead transcription factor 3 (FOXO3) pathway, which is a signal pathway for the induction of antioxidant enzymes. The AMPK activator (AICAR) significantly restored the expressions of CAT and GPx with the reduction of ROS levels and cytotoxicity, whereas the opposite changes were observed with an AMPK inhibitor (Compound C). In addition, knockdown of AMPK by its specific siRNA markedly enhanced ROS generation and cytotoxicity. In conclusion, this study shows that AgNPs causes cytotoxicity by oxidative stress-induced apoptosis and damage of cellular components. Studies also demonstrate that down-regulation of Nrf2-mediated OGG1 in exposure to AgNPs occurs through ERK and AKT inactivation. AgNPs-induced oxidative cytotoxicity also might be at least partially attributed to the diminished antioxidant enzyme activities via the inhibition of the AMPK-FOXO3 pathway. Keywords: Silver nanoparticles; oxidative stress; glutathione; apoptosis; 8-Oxoguanine DNA glycosylase 1; 8-Oxoguanine; NF-E2-related factor 2; Reactive oxygen species; Antioxidant enzyme; AMP-activated protein kinase; Forkhead transcription factor 3.

Abbreviations used: AgNPs, silver nanoparticles; ROS, reactive oxygen species; GSH, glutathione; Δψm, mitochondrial membrane potential; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase; HR-MAS NMR, high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance; TEM, transmission electron microscopy; DLS, dynamic light scattering; THF, tetrahydrofuran; MTT, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide; DCF-DA, 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate; PI, propidium iodide; GCLC, catalytically active subunit of glutamate-cysteine ligase; GSS, glutathione synthetase; JC-1, 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide; CMAC, tert-butoxycarbonyl-Leu-Met-7-amino-4-chloromethylcoumarine; DPPP, diphenyl-1-pyrenylphosphine; SP600125, anthrax [1,9-cd] pyrazol-6(2H)-one; PBS, phosphate buffered saline; TSP, 3-(trimethylsilyl) propionic-2, 2, 3, 3-d4 acid; LMA, low melting agarose; siRNA, small interfering RNA; NAC, N-acetyl cysteine; γ-GCL, γ-glutamate cystein ligase; 8-oxoG, 8-Oxoguanine; OGG1, 8-Oxoguanine DNA glycosylase 1; Nrf2, NF-E2-related factor 2; ERK, Extracellular regulated kinase; PKB or AKT, protein kinase B; CAT, catalase; GPx, glutathione peroxidase; AMPK, AMP-activated protein kinase; FOXO3, forkhead transcription factor 3; SOD, superoxide dismutase; AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranosyl 5′-monophosphate; ChIP, chromatin immunoprecipitation; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; BER, base excision repair; MAPK, mitogen activated protein kinase; TRITC, tetramethylrhodamine isothiocyanate.