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Anti-inflammatory effect of physical damage-induced zebrafish model and identification of zebrafish mechanism about H2O2 induced oxidative stress

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Abstract
현재 in vivo 실험에서 가장 널리 쓰이는 동물은 마우스, 쥐와 토끼이다. 그러나 최근에 동물학대로 인한 윤리적인 문제가 대두되면서 이들의 이용과 관련하여 법적인 제약이 생겨났다. 이로 인해 2000년대에 in vivo 실험에서 제브라피쉬가 등장하여 점차 많이 사용되고 있다. 제브라피쉬는 마우스와 비슷하게 수명은 2년 정도이고 생후 3개월이면 번식이 가능하다. 계절에 관계없이 암컷은 일주일 간격으로 200-300개의 알을 낳고 체외수정을 하며 발생배가 투명하기 때문에 일반 해부현미경 하에서 쉽게 발생의 모든 과정을 관찰할 수 있다.이들은 발생이 매우 빨라 초기 세포분열이 대장균 보다도 빠른 15분 간격으로 진행되며, 발생 6 시간째에 gastrulation 이 시작되어4시간 만에 마치고, 12 시간이 지나면 눈의 형태형성이 이미 시작된다. 수정 후 24 시간이 지나면 심장의 박동과 혈액순환을 관찰할 수 있다. 제브라피쉬는 허파를 제외하고는 간과 췌장 그리고 지라와 흉선 등 면역계를 포함한 대부분의 기관을 가지며, 특히 돌연변이 연구에서 밝혀지는 여러 결과들이 인간의 유전질환과 매우 유사한 것으로 밝혀졌고, 인간과의 유전적 상동성도 현재 약 90%까지 일치하는 것으로 밝혀졌다.

제브라피쉬 모델의 장점
▶ 제브라피쉬의 수정란을 대량으로 쉽게 확보할 수 있음
▶ 발생이 매우 빨라 대부분의 조직 및 장기가 하루 만에 형성
▶ 투명한 난-현미경으로 발생단계, 혈류 흐름 및 형태적 관찰이 용이
▶ 척추동물로서 유전체 구성이 인간과 비슷함.
마우스와 인간과 아주 유사한 게놈 구조를 가지면서도 선충이나 초파리에서나 가능한 유전학적, 세포생물학적인 실험실이나 대규모 연구가 가능하다. 제브라피쉬의 발생배는 직경 0.7mm 정도로 작기 때문에 96-well microplate 에 3-5 embryo 정도씩 분주가 가능하며 소량의 화합물에 대해서도 형태 형성, 혈관형성 등 생체를 이용한 생리활성물질 검출이 가능하다.

1, 일반적으로 제브라피쉬에서 염증실험은 형질전환 제브라피쉬를 사용하여 측정하는 것이 주요 실험방법이다. 그러나 wild type zebrafish를 사용하여 항염증을 측정하는 방법은 아직까지 나와있지 않다. 이 연구에서는 wild type 제브라피쉬에서 물리적인 데미지를 입혀 염증을 유발하는 방법을 사용하였다. 물리적인 데미지를 입혀서 제브라피쉬를 실험한 결과 이미 항염활성이 있는 덱사메타손과 레스베라트롤이 이미 알려진 것과 거의 같은 항염 활성을 보였다. 그리고 웨스턴블롯과 사이토카인 키트에서 COX-2와 iNOS가 감소되었고 PGE2, IL-1beta, TNF-alpha 가 감소되었다. 이러한 결과 첫번째로 wild type 제브라피쉬를 사용하여 항염증 활성을 확인 할 수 있는 것이고, 두번째로 기존의 자극인자를 사용하지 않고 물리적 데미지를 입혀서 염증을 측정할 수 있었던 것이다.
2, 푸코이단은 생리활성이 뛰어나기에 여러 가지로 사용된다. 그러나 제주도에서 많이 채취되는 감태유래의 후코이단의 경우는 현재 후코이단의 원료로 거의 사용되지 않는다. 따라서 이 감태유래 후코이단의 항염증활성을 제브라피쉬를 사용하여 기존에 판매되어지고 있는 후코이단과 비교하여 기존 후코이단에 대용으로 사용할 수 있는지 알기위해 항염증 활성을 측정하였다. 그 결과 RAW264.7 세포와 제브라피쉬에서 동일한 결과가 나왔고, 기존의 후코이단과 비교하여 비슷하거나 더 좋은 항염증 활성을 나타내었다. 따라서 이 감태 유래 후코이단의 활성을 기존의 후코이단과 비교하여 기존 후코이단 대용으로 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
3. 제브라피쉬를 사용하여 독성의 측정은 wild type 제브라피쉬로 가장 쉽고 빠르게 확인 할 수 있는 방법이다. 이 연구에서는 제브라피쉬를 사용하여 PFF-A의 항산화 활성을 측정하였다. 그 결과 PFF-A는 과산화수소의 제브라피쉬 발생배에 대한 독성에 대한 뛰어난 보호효과를 보였고, 형광 시약인 DCF-DA와 DPPP를 사용하여 분석한 결과도 항산화 활성이 뛰어남을 알 수 있었다. 이 결과 PFF-A는 항산화 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
기존의 제브라피쉬를 사용한 염증활성에 대한 연구는 모두 형질전환 제브라피쉬를 사용하여 측정하였다. 하지만 이는 형질전환 제브라피쉬를 만들거나 따로 구입을 하지 못하는 실험실의 경우 제브라피쉬 사육 시스템을 갖추고도 제대로 필요한 실험을 못하는 경우가 발생하는 것이 된다. 따라서 wild type의 제브라피쉬를 사용하여 염증을 스크리닝 할 수 있게 된다면 보다 더 제브라피쉬를 사용한 염증 연구가 활발해 질 것으로 기대할 수 있다. 실험의 결과 wild type의 제브라피쉬에서도 충분히 염증을 스크리닝 할 수 있었고, 기존에 염증 유발물질로 많이 쓰이는 LPS 뿐만 아니라 물리적 데미지를 제브라피쉬에 가하여 염증을 유발하여도 충분히 염증 활성을 측정할 수 있음을 확인였다.
따라서 이 제브라피쉬를 사용하여 항염증 활성과 항산화 활성을 측정하였고, 이 실험방법들을 다른 실험에도 충분히 적용시킬 수 있었다. 앞으로도 이 방법들을 사용하여 항염증과 항산화 스크리닝을 할 것이다.
Author(s)
고창익
Issued Date
2011
Awarded Date
2012. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000005907
Alternative Author(s)
Ko, Chang ik
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
국문초록 iv
List of Figures vii
Part I Protocol development for Anti-inflammatory effect evaluation on physical damage-induced zebrafish model
Abstract 2
Introduction 3
MATERIALS AND METHODS 4
Origin and maintenance of parental zebrafish 4
Waterborne exposure of embryos to chemicals and cutting 4
Estimation of tail cutting induced intracellular ROS and NO generation and image analysis 5
Estimation of tail cutting induced intracellular ROS and NO generation and image analysis 5
Measurement of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1ß) production 6
Determination of PGE2production 6
Western blotting 7
RESULT AND DISCUSSION 7
Part II Anti-inflammation effect of fucoidan from Eclonia cava on physical damage and LPS-induced zebrafish
ABSTRACT 18
INTRODUCTION 19
Material and methods 20
Materials 20
Crude fucoidan separation from Ecklonia cava 21
Cell culture 21
Determination of NO production 22
Western blot analysis 22
Origin and maintenance of parental zebrafish 23
Estimation of intracellular NO generation and image analysis 23
Estimation of intracellular ROS generation and image analysis 24
Western blotting of zebrafish 25
Result and discussion 25
Part III Protective effects of phlorofucofuroeckol-A against H2O2-induced oxidative stress in zebrafish embryo
Abstract 38
Introduction 39
Material and mathods 40
Origin and maintenance of parental zebrafish 42
Waterborne exposure of embryos to compounds and H2O2 42
Measurement of heart-beat rate 42
Estimation of intracellular ROS generation and image analysis 43
Lipid peroxidation inhibitory activity and image analysis 43
Western blotting 44
Result and discussion 44
REFERENCE 51
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
고창익. (2011). Anti-inflammatory effect of physical damage-induced zebrafish model and identification of zebrafish mechanism about H2O2 induced oxidative stress
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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