Preparative isolation and purification of bioactive compounds from marine algae using centrifugal partition chromatography and theiranti-inflammatory activity

Abstract

고속원심분배크로마토그래피는액체-액체크로마토그래피의일종으로서섞이지않는두층간의용매에서성분의분배의차에의해분리되는크로마토그래피기술로서 90%이상의순수한물질을대량으로빠르게, 단일공정으로정제하는데용이하다. 또한기존의분리법이갖는용매의소비가많고, 정제소요시간이길며, 반복적인분리공정과생리활성물질의낮은수집과시료의고정상흡착등과같은문제에대한대체방법으로서제시되어지고있다. 최근고속원심분배크로마토그래피는육상식물로부터생리활성물질을분리정제하는데널리이용되어지고있는반면, 해조류의경우에는 Ascophyllumnodosum 와같은 소수의 종에서만 이용되어졌다. 그러므로 우리는 제주도 해안에 널리 서식 하는 갈조류의 일종인 감태와 꽈배기모자반을 고속원심분배크로마토그래피를 이용하여 생리활성 물질을 분리 정제하였다. 1. 감태(Ecklonia cava)는 70% EtOH로 3시간 동안 3번에 걸쳐 초음파 추출을 하여, 10,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 상층액을 농축 후, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water fraction으로 나누었으며, 기존 보고에서 가장 많은 생리활성 물질인 phlorotannins이 많다고 알려진 ethyl acetate fraction을 가지고, n-hexane / ethyl acetate / methanol / water 용매를 비율 별에 따라 분배 계수 값인 K-value를 구하였다. 그리고 가장 우수한 분배 계수 값을 갖는 용매 조건인 n-hexane, ethyl acetate, methanol / water (2:8:3:7)의 조건으로 하강모드 (Descending mode)로 하여 2ml/min의 유속에 1000rpm의 원심속도에서 고속원심분배크로마토그래피를 작동하였다. 그 결과, 6개의 fraction을 얻었고, 90%이상의 순도를 갖는 Dieckol과 6,6-bieckol은 E. cava ethylacetate 층 500mg 중 각각 34.7mg과 41.2mg을 얻었고, 나머지 fraction에서는 phloroeckol, 2,7-phloroglucino-6,6-bieckol과 분자량 527m/z의 Unknown compound 1, 분자량 866m/z의 Unknown compound 2,분자량 744m/z의 Unknown compound 3,분자량 974m/z의 Unknown compound 4를 각각 획득하였다. 그리고 n-hexane, ethyl acetate, methanol / water (2:7:3:7)의 조건의 fraction 6에서는 90%이상의 순도의 phlorofucofuroeckol-A를 31.1mg을 수집할 수 있었다. 2. 꽈배기 모자반(Sargassumsiliquastrum)은 80% MeOH로 3시간 동안 3번에 걸쳐 초음파 추출을 하여, 10,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 상층액을 농축 후, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-buthanol, water fraction으로 나누었으며, online HPLC 분석 결과 높은 활성 물질이 다량 함유된 chloroforum fraction을 가지고, n-hexane / ethyl acetate / methanol / water 용매를 비율 별에 따라 분배 계수 값인 K-value를 구하였다. 그리고 가장 우수한 분배 계수 값을 갖는 용매 조건인 n-hexane, ethyl acetate, methanol / water (5:5:7:3)의 조건으로 하강모드 (Descending mode)로 하여 2ml/min의 유속에 1000rpm의 원심속도에서 고속원심분배크로마토그래피를수행하였다. 그 결과, 5개의 fraction을 얻었고, 80%이상의 순도를 갖는 Unknown compound 1과 푸코잔틴을 꽈배기 모자반 chloroforum 층 500mg 중 각각 105 mg과 10 mg을 얻었고, 나머지 fraction에서는 분자량 408 m/z을 갖는 Unknown compound 2와 분자량 408 m/z의 Unknown compound 3, 분자량 424m/z의 Unknown compound 4, 분자량 428m/z의 Unknown compound 5를 각각 획득하였다. 3. 꽈배기 모자반에서 분리된 fraction 중, 푸코잔틴을 제외한 4개의 fraction을 가지고 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증성 매개인자 중 NO 생성의 억제에 대한 활성을 측정하 결과, fraction 1 (5573F1)에서가 가장 우수한 저해 활성을 보여, 5573F1의 H-NMR과 C-NMR분석결과 Jang et al. (2005) 에 의해 보고된바 있는 Sargacromanol E로 확인되어 졌다. Sargacromanol E을 가지고 염증성 매개인자인 NO, PGE2, IL-1b와 TNF-α 의 생성 저해 활성을 측정한 결과, 농도의존적으로 억제하는 것을 확인 하였다, 항염증 활성의 작용기전 규명을 위해, LPS로 자극된 세포 내 p38, JNK, ERK 1/2 와 같은MAPKs 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과, MAPKs 인산화를 억제함을 western blot을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 Sargacromanol E이가 MAPKs를 조절함으로써 항염증활성을 나타내는 것으로 사려된다.