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제주도내 p22phox관련만성육아종질환원인과치료에따른 therapeutic virus 디자인그리고 superoxide에의한 EMT 유도연구

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Alternative Title
Cause and Cure for unusual p22phox defi-cient Chronic Granulomatous Disease on Jeju Island : Therapeutic vector design and New mechanism for superoxide mediated EMT
Abstract
1. HeLa cell에서 NADPH oxidase 2는 ROS의 증가에 따른 EMT를 유도한다.

Epithelium-to-mesenchyme transitions (EMTs)는 세포들의 형태 및 behavioral 변화를 유도하며, 이 과정 동안 Epithelial marker인 E-cadherin의 발현감소와 mesenkymal marker인 snail, slug 그리고vimentin의 발현증가를 가져온다. 본 연구에서는 mammary epithelial cell인 HeLa cell을 이용하여Hela-p40phox model system을 만들어 ROS에 의한 EMT유도과정에 대해 연구하였다. NOX 2 와 NOX5 mRNA증가는 ROS증가를 유도하였으며, 이에 따른 matrix metalloproteinase (MMPs)의 발현증가와 cell migration이 증가를 유도함을 알 수 있었다. 또한 TGF-β1은 EMT 유도물질로 알려져 있는데, TGF-β1처리에 의해 EMT 유도와 함께NOX2의 발현증가와 ROS 생성이 증가됨을 알 수 있었다. 하지만 cell의 형태학적 변화는 없었다. 이는 ROS가 EMT유도에 필요한switching역할을 하면서도 EMT과정에서의 세포형태의 변화에 필수조건과는 무관하다는 것을 알 수 있다.

2. p22-phoxdeficient Chronic Granulomatous Disease에 대한 유전적 분석: 제주도내의 CGD환자는 p22phox 유전자의 동일한 유전적 돌연변이에 의해 발병하는 것임을 알 수 있었다

Chronic granulomatous disease (CGD)는 세균및곰팡이의 반복감염에 의해발생되는 드문유전질환이다. 이는 NADPH 산화 효소의 결함의 결과로 phagocyte에서 reactive oxygen species가 생성되지 못하여 발생된다. CGD는 일반적으로1,000,000중 3-4명이 발병하는데 비해 제주도에서는 20.7명으로 높은 발병율을 보인다. 본 연구에서는 제주도내 거주 CGD환자의 유전자를 분석한 결과 CYBA gene 의 exon 1(c.7C>T) 의 동일한 유전적 변이에 의해 발병함을 알 수 있었다. 이것은 제주 지역의 만성육아종질환의 유전 변이가동일한 유전적인 계보 (pro-band)에서 유래하였기 때문이라고 여겨져 이에 본 연구는 제주도내 만성육아종질환 보인자의 실태 파악을 해보았습니다. 만성육아종 보인자 실태파악을 위한 방법으로 간단하면서도 빠른 nested PCR방법을 이용한 시스템을 시행하였습니다. Nested PCR에 의한 보인자 조사에는 서귀포지역을 중심으로 모두 704명의 population을 선정하여조사하였습니다. 제주도 서귀포시 지역거주 704명을 대상으로 specific primers를 이용한 nested PCR 방법을 이용하여 p22phox 결함 CGD환자에 대한 p22phox heterozygote carrier 를 조사한 결과 9명의 p22phox heterozygote carrier 를 확인할 수 있었는데 이는 100명중 1.3명의 높은 빈도수를 나타내는 결과로 타지역에 비해 높은 빈도수를 나타냄을 알 수 있었습니다. 단일 유전자의 결함에 의해 생기는 primary imunodeficiency disease인만성육아종 질환은 자가 조혈모세포를 이용한 유전자 치료가 큰 대안이 될 수 있습니다. 정상과립구의 5-10%에 해당하는oxidase활성을 가진 보인자의 경우에도 정상적인 생활을유지할수있는 것을 미루어 볼때 정상과립구의 3-10%에 해당하는 NADPH oxidase 활성을 회복시키더라도CGD에 대한 근본적인 치료법이 될 수 있다고 생각됩니다. 본 연구에 사용된 렌티바이러스 backbone으로 pLL3.7 기본 construct에서 U6 promoter대신 EF1αpromoter로 대체하였으며, 다음에 p22phox 유전자를 넣어 pLL3.7EF1a-p22phox를 만들어 본 연구에 사용하였습니다. 또한in vitro에서 primary cell line을 이용한 실험을 위해 hTERT와 bmi-1 promoter를 이용한 immortalization 방법도 정립 할 수 있었습니다. 이는 향후 p22phox–Lentiviral vector와 관련한 CGD 환자 cell line을 이용한 실험에 기초자료로 이용될수 있으리라 사료됩니다.
Epithelium-to-mesenchyme transitions (EMTs) are characterized by morphological and behavioral changes in cells. During an EMT, E-cadherin is down-regulated while snail, slug and vimentin are up-regulated. The goal of this study was to understand the role ROS plays in EMT using a Hela-p40phox model system: ROS mediated EMT in mammary epithelial cells. We showed that mRNA of NOX 2 and NOX 5 are increased, and with the increased expression of several matrix metalloproteinase (MMPs) in response to ROS. Moreover, these changes were reversible upon removal of ROS. Down-regulation of E-cadherin and up-regulation of snail, slug and vimentin occurred in transcriptional level. Interestingly, TGF-β1-induced EMT in HeLa cells was significantly increased ROS. Together, these data suggest that ROS switching is necessary for increased EMT but is not required for the morphological changes that accompany EMT.
Author(s)
김영미
Issued Date
2011
Awarded Date
2012. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/common/orgView/000000005920
Alternative Author(s)
Kim, Young Mee
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 의학과
Advisor
조문제
Table Of Contents
CONTENS ⅰ
LIST OF TABLES ⅴ
LIST OF FIGURES ⅵ
Ⅰ. PART I. NADPH oxidase NOX 2 is responsible for mediated EMT signaling in HeLa cells 1
1. ABSTRACT 2
2. INTRODUCTION 3
3. MATERIALS AND METHODS 7
3.1. Cell culture and transfection 7
3.2. Western blots and antibodies 7
3.3. RT-PCR analysis 8
3.4. Plasmid construction 8
3.5. NADPH Oxidase Assay 9
3.6. Gelatin Zymography 10
3.7. In vitro wound healing assay 10
4. RESULTS 13
4.1. p40phoxexpression and ROS generation during TGF-β1induced EMT 13
4.2. Localization of the full-length p40phox in transfected cells 18
4.3. Introduction of p40phox gene induced NADPH oxidase 2 (NOX 2) sub-units and enzymes involved in homeosis of creative oxygen sepsis (ROS)
23
4.4. Overexpression of p40phox induced cell growth rate increase and reduced of p21 and p 26
4.5. Activation of matrix metalloproteinase by over-expression of p40phox in HeLa cells involved reactive oxygen species 29
4.6. ROS mediate p40phox induced EMT 33
4.7. p40phox mediated YB-1 increase through ROS generation 36
4.8. ROS generation induced EMT blocked by inhibitors 37
5. DISCUSSION 41
II. PART II. Genetic Analysis of 10 Unrelated Korean Families with p22-phoxdeficientChronic Granulomatous Disease: An Unusually Identical-Mutation of the CYBA Gene on Jeju Island, Korea 51
1. ABSTRACT 2
2. INTRODUCTION. 53
3. MATERIALS AND METHODS 55
3.1. Patients 55
3.2. DHR flow cytometry 55
3.3. Western blot analysis of the NADPH oxidase components 56
3.4. Isolation of total RNA and RT-RCR 56
3.5. Isolation and amplification of genomic DNA of CYBA 57
3.6. Sequence analysis 58
4. RESULTS 59
5. DISCUSSION 65
III. PART III. Survey on the present condition of heterozygote carriers with p22-phox-deficient CGD on Jeju Island, Korea 69
1. ABSTRACT 70
2. INTRODUCTION 72
3. MATERIALS AND METHODS 74
3.1. Study population 74
3.2. Nested PCR amplification of a specific region on p22phox exon 174
3.3. Sequence analysis for precision test of heterozygote-specific primers 75
3.4. Data analysis 76
4. RESULTS 77
5. DISCUSSION 86
IV. PART IV. Development of Lentiviral vector and efficient infection method for the gene therapy of p22phox defective CGD 88
1. ABSTRACT 89
2. INTRODUCTION 90
3. MATERIALS AND METHODS 94
3.1. Construction of vectors encoding p22phox 94
3.2. Maintenance of cell culture and transfection 94
3.3. Vector production 94
3.4. Virus titration 95
3.5. Transduction and calculation of the titer in transducing units 95
3.6. Infection of hTERT and Bmi-1 constructs 96
3.7. Induction of differentiation 97
3.8. Dihydrorhodamine 123 FACS quantitation of superoxide production 98
3.9. Isolated WBC (white blood cell) 98
4. RESULTS 100
5. DISCUSSION 116
V. REFERENCES. 120
VI. ABSTRACT IN KOREAN 134
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김영미. (2011). 제주도내 p22phox관련만성육아종질환원인과치료에따른 therapeutic virus 디자인그리고 superoxide에의한 EMT 유도연구
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