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Ferritin subunit cDNA cloning, molecular characterization and expression analysis from manila clam Ruditapes philippinarum

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Abstract
모든 생명체에 있어 철 이온은 매우 중요한 미네랄 중 하나로 산소 운반, 전자 이동, DNA 합성, 면역 및 여러 효소 반응 등 생체 내 많은 반응에 관여한다.
그러나 이러한 철 이온이 체내에 과도하게 축적이 되면 Fenton 반응에 의해 활성산소종 (Reactive Oxygen species)을 생성하여 지질과 단백질 산화 및 DNA 파괴 등으로 이어진다. 따라서 생체는 이러한 부작용을 막기 위해 철 이온 농도를 조절하여 항상성 (homeostasis) 을 유지하고자 하는 시스템이 필요하다.
페리틴은 철 이온의 항상성을 유지하는 시스템 중 중요한 단백질 종류로, 포유류, 세균, 식물 등 넓은 범위의 생물에게서 발견할 수 있다. 페리틴은 체내의 남는 철 이온을 독성 형태 (Fe2+)에서 비(非)독성 형태 (Fe3+)로 바꾸어 장기간 저장하거나 철분이 부족 시 방출하는 역할을 한다.
페리틴은 약 4500개의 무기 형태의 철 이온을 저장 할 수 있는 공간을 중심으로 24개의 단량체들이 둘러싸인 형태를 지닌 단백질이다. 단량체는 분자량과 주로 분포된 조직에 따라 H subunit 과 L subunit으로 나뉠 수 있다. H subunit은 L subunit 보다 조금 더 무거운(Heavy) 분자량을 지녔고 심장(Heart)에서 비율이 높다. 반면, L subunit은 상대적으로 가벼운(Light) 분자량에 간(Liver) 조직에서 비율이 높다. 각각의 단량체는 특성과 기능이 다른데, H subunit은 ferroxidase라는 불리는 7개의 아미노산잔기가 있어 철 이온을 붙잡아 산화시킨다. L subunit은 산화된 철을 페리틴 핵 내부로 저장시키는 역할을 한다.
이번 연구에서는 바지락 Ruditapes philippinarum 에서 발현된 페리틴 subunit의 cDNA의 전체 염기서열과 아미노산 서열을 밝혀서 분자 유전학적으로 분석하고 mRNA 발현 및 단백질 발현 실험을 수행하였다. 그 결과, 이 실험에서 연구한 바지락 페리틴 subunit은 연체동물의 H subunit에 속하는 유전자임을 밝혔다. 바지락 H subunit의 mRNA발현량은 각 조직별로 다른 발현 분포도를 보였는데 아가미와 혈구 조직에서 높은 발현을 보였다. 또한 아가미 조직에서 세균 감염 시 시간 별로 발현되는 양상을 조사한 결과, 비교적 짧은 시간 내 유의적으로 발현됨을 밝혔다. 그리고 바지락의 H subunit의 재조합 단백질은 iron-chelating 실험을 통해 단백질 농도에 따라 철 이온의 결합능이 비례함을 보였다.
In all living organism, iron is essential element for wide range of physiologic processes, but excess free iron reacts with oxygen, it can produce reactive oxygen species (ROS) by Fenton reaction which have toxicity to DNA, protein and lipids. Thus living organisms have tight iron regulating system to protect those oxidative injury. Ferritin is a major iron regulating protein and one of a highly conserved conformation in a wide range of organisms.
Ferritin serves detoxification of the toxic form iron (Fe2+) to safe form (Fe3+) and store 4500 detoxified iron atoms in shell which is composed 24 subunits. When the biological is placed under iron scarcity conditions, the stored iron ion can be used.
There are two types of ferritin subunit distinguished by molecular weight and ratio in different cell type. One is H subunit, H means Heavy MW and most found in Heart while L subunit means Light MW and Liver.
In this study, ferritin subunit gene from manila clam Ruditapes philippinarum cDNA library was identified as a ferritin H subunit (RpFer). And molecular characterization and gene analysis results showed that also RpFer is belong to mollusk ferritin H subunit.
And mRNA expression experiment in different tissues was performed. Gill and hemocytes tissues were observed significantly higher relative mRNA expression level than in any other manila clam tissues. After bacterial challenge, RpFer was researched in gill tissues and the results was showed that the RpFer was up-regulated and significantly increased until 12 hr and rapidly decreased at 24 hr level after infection compare to unchallenged group using a negative control.
Recombinant protein was expressed and purified for ferrous-ion chelating assay. The recombinant clam ferritin H subunit protein was able to bind iron, and the iron concentration was decrease as more protein.
Author(s)
김효원
Issued Date
2011
Awarded Date
2012. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000005925
Alternative Author(s)
Kim, Hyo Won
Affiliation
제주대학교
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
이제희
Table Of Contents
요 약 문 I
Abstract II
LIST OF FIGURES AND TABLES III
I. INTRODUCTION 1
II. MATERIALS AND METHODS
1. Experimental animals 4
2. Tissue sampling, RNA isolation, cDNA synthesis and normalization 4
3. cDNA data base of clam and identification of RpFer 5
4. Cloning of clam ferritin RpFer into the pMal-c2X 6
5. Analysis of cDNA and putative amino acid sequence 6
6. Over-expression of recombinant RpFer protein and purification 7
7. mRNA expression of RpFer by Real-time PCR 7
8. Ferrous-ion chelating assay 8
III. RESULTS
1. Sequence analysis of RpFer 9
2. Homology analysis of RpFer 11
3. Phylogenetic analysis 14
4. Expression and purification of rRpFer in E. coli BL21(DE3) cells 16
5. mRNA expression pattern of RpFer in different tissues 18
6. mRNA expression pattern of RpFer in gill after bacterial challenges 20
7. Ferrous-ion chelating assay of rRpFer 22
IV. DISCUSSION 24
V. REFERENCE 27
VI. ACKNOWLEDGEMENT 32
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김효원. (2011). Ferritin subunit cDNA cloning, molecular characterization and expression analysis from manila clam Ruditapes philippinarum
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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