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Genomic Identification and Molecular Characterization ofTwo Interferon Regulatory Factorsand Three Complement Component Genes From Rock bream, Oplegnathus fasciatus

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Abstract
돌돔(Oplegnathus fasciatus)은 한국 양식산업에서 주목 받고 있는 주요 양식어종이다. 그러나 해가 거듭될 수록 돌돔에게 여러 질병이 발병되면서 양식생산에 있어 악영향을 주고 있다. 돌돔에서 확인되는 질병 중에는 Streptococcos iniae가 원인인 연쇄상구균증(Streptococcosis)과 Edwardsiella tarda가 원인인 에드워드증(Edwardsiellosis)과 같은 세균성질병과 이리도 바이러스(Iridovirus)로 인한 바이러스성 질병 등이 있다. 이런 질병은 단독적으로 발병되거나 여러 질병이 복합적으로 발병되어 돌돔 양식에 큰 경제적인 손실을 주고 있는 실정이다.
따라서 양식산업에서 빈번히 발생되는 질병을 예방하고 발병한 질병을 빠르게 대처할 수 있어야만 양식어종을 안정적으로 생산할 수 있다. 이를 위해 감염성 질병에 대한 어류의 방어체계를 이해하는 것이 기본적으로 필요하다. 특히 병원체에 대한 1차 방어체계인 선천면역을 연구해야만 한다. 그리하여 이 논문에서는 감염에 따른 선천면역체계를 분자유전학적인 수준에서 이해하고자 interferon regulatory factor 4 (IRF4) 와 8 (IRF8) 및 3종류의 complement 1q (C1q) 유전자를 동정하였다.
IRF4와 IRF8은 B 림프구를 자극하여 림프구 발달과 항체(immunoglobulin; Ig)의 일부분인 경쇄(light chain)의 전사를 조절하는 분자들의 활성을 촉진시킨다. 이 두 개의 IRF는 매우 밀접하게 연관되어 있으며 면역세포 중 림프 및 골수세포에서 높게 발현된다고 알려져 있다. 이 논문에서는 돌돔에서 발현되는 IRF4 (RbIRF4)와 IRF8 (RbIRF8)의 cDNA 서열과 유전체 서열을 돌돔 cDNA library와 BAC library에서 각각 스크리닝하여 동정하였다. RbIRF4의 cDNA 전체서열은 3442 염기쌍(bp)로 462개의 아미노산서열을 암호화하고 있다. 또한 유전체 서열의 크기는 9262bp로 8개의 exon과 7개의 intron으로 구성되었다. RbIRF8인 경우 cDNA 전체서열은 422개의 아미노산을 암호화하고 있는 2186 bp로 이루어졌으며 유전체 서열의 크기는 4120 bp로 9개의 exon과 8개의 intron으로 구성되어 있다. RbIRF4와 RbIRF8의 아미노산 서열에서는 공통적으로 tryptophan pentad-repeat가 포함된 DNA-binding domain (DBD)과 IRF-association domain (IAD)가 확인되었다. RbIRF4와 RbIRF8 유전자의 5' flanking region에는 면역유전자의 전사를 조절하는 전사조절인자들의 결합부위가 존재하였다. real time PCR를 이용하여 RbIRF4와 RbIRF8 유전자의 발현양상을 확인한 결과 건강한 돌돔에서는 림프골수계 조직에서 가장 많이 발현되었다. 이리도바이러스와 E. tarda, S. iniae를 인위 감염시킨 돌돔에서는 두신(head kidney)과 비장(spleen)에서 높은 발현양상을 보였다. 이러한 결과를 통해 돌돔에서 발현되는 RbIRF4와 RbIRF8도 바이러스와 병원균에 대한 보호기능을 담당하고 덧붙여 IRF 분자들이 경골어류에서는 면역조절 분자로서의 기능을 하는 것이라 유추 할 수 있다.
보체인자 1q(C1q)는 보체 C1 복합체를 구성하는 부분인자 중 하나로 면역적 또는 비면역적 ligand를 먼저 인식하고 결합하여 classical complement pathway가 시작되도록 하는 주요 단백질이다. 이 논문에서는 돌돔에서 발현되는 3종류의 C1q 유전자를 최초로 동정하였다. 기존에 밝혀진 C1q A, B, C와 유사한 특징을 보이는 3종류의 유전자를 각각 RbC1qAL, RbC1qBL, RbC1qCL라고 명명하였다. RbC1qAL는 260개의 아미노산 서열을 암호화한 780 bp의 염기서열로 이루어져 있으며 RbC1qBL인 경우 240개의 아미노산을 구성하는 720 bp, RbC1qCL인 경우 726 bp 서열이 242개의 아미노산을 암호화하고 있다. 3종류의 RbC1q 아미노산 서열에서는 N말단에 신호서열과 collagen-like region(s)을, C말단에는 C1q 분자들이 가지는 공통 domain를 확인할 수 있었다. C1q의 특징은 Gly-X-Y 서열반복으로 3종류의 RbC1q 아미노산 서열에서 확인되었고RbC1qAL과 RbC1qCL에는 대식세포의 포식작용을 활성화시키는 CLR연계 서열(CLR-associated sequence)인 49GEKGEP54와 70GEKGEP75가 각각 위치하였다. RbC1qAL과 RbC1qCL의 유전체서열은 6개의 exon으로 RbC1qBL인 경우 5개의 exon으로 구성되어있었다. 계통수분석을 한 결과 3종류의 RbC1q 분자들은 다른 어류 보체 cluster에 속함을 알 수 있었다. 이들 유전자의 발현양상은 비장과 간에서 가장 많이 발현되었으며 특히 돌돔에 E. tarda와 S. iniae, 이리도 바이러스를 인위감염시킨 경우 감염 초기에 RbC1q의 발현 양이 증가한 반면 lipopolysaccharide를 인위적으로 주입한 경우 주입 후기에 발현 양이 증가하였다. 이러한 결과를 토대로 돌돔에서는 보체인자인 RbC1q 분자들이 병원체 감염에 대한 면역작용을 담당하며 특히 감염 초기에 결정적인 기능을 담당하는 것으로 생각된다.
Author(s)
S.D.N.K. Bathige
Issued Date
2013
Awarded Date
2013. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006222
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
이제희
Table Of Contents
1. Introduction ......................................................................................................................................................... 2
2. Materials and Methods ...................................................................................................................... 4
2.1. Identification of rock bream IRF4 and IRF8 cDNAs ......................................................... 4
2.2. Identification of rock bream genomic DNA .......................................................................... 5
2.3. Molecular characterization of RbIRF4 and RbIRF8 ........................................................... 5
2.4. Experimental fish and immune challenges ............................................................................ 6
2.5. Total RNA extraction and first strand cDNA synthesis from different tissues ........... 7
2.6 qRT-PCR analysis of RbIRF4 and RbIRF8 ............................................................................ 8
3. Results ...................................................................................................................................................... 9
3.1 Molecular characterization of RbIRF4 and RbIRF8 ............................................................ 9
3.2 Genomic structure analysis of RbIRF4 and RbIRF8......................................................... 18
3.3 Promoter sequence analysis of RbIRF4 and RbIRF8 ....................................................... 20
3.4 Gene expression patterns of RbIRF4 and RbIRF8 in healthy rock bream ................. 23
3.5 Immune-responsive expression of RbIRF4 and RbIRF8 ............................................. 24
4.0 Discussion ..................................................................................................................... 28
CHAPTER 2: Three complement component 1q genes from rock bream, Oplegnathus fasciatus: Genome characterization and potential role in immune response against bacterial and viral infections………………………………………………………………………………………………………………..….……………..……………..35
1. Introduction........................................................................................................................................ 36
2. Materials and Methods ................................................................................................................... 38
2.1 Rock bream cDNA library construction ............................................................................... 38
2.2 BAC library and genomic sequence screening ................................................................... 38
2.3 Identification of C1q genes from the rock bream database ............................................. 38
2.4 Sequence analysis of C1q genes and 3D modeling ........................................................... 39
2.5 Animals, immune challenge experiments, and tissue collection ................................... 40
2.6 Extraction of total RNA and synthesis of first-strand cDNA ......................................... 40
2.7 Quantitative analysis of mRNA expression ......................................................................... 41
3. Results ................................................................................................................................................... 42
3.1 cDNA sequence characterization of rock bream C1qs ..................................................... 42
3.2 Amino acid sequence comparison and phylogenetic analysis of the RbC1qs ........... 45
3.3 Genomic analysis of the RbC1qs ............................................................................................ 49
3.4 Tissue distribution analysis of the RbC1qs .......................................................................... 51
3.5 Temporal expression analysis of RbC1qs after immune challenges ............................ 51
4. Discussion ............................................................................................................................................ 54
References ................................................................................................................................................ 60
Acknowledgements ............................................................................................................................... 69
Degree
Master
Publisher
제주대학교
Citation
S.D.N.K. Bathige. (2013). Genomic Identification and Molecular Characterization ofTwo Interferon Regulatory Factorsand Three Complement Component Genes From Rock bream, Oplegnathus fasciatus
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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