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COMPARATIVE ANALYSIS OF A CYSTEINE PROTEASE INHIBITOR, CYSTATIN B FROM ATELEOST Oplegnathus fasciatus AND TWO MOLLUSK SPECIES Haliotis discus discuss AND Ruditapes philippinarum

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Abstract
Cystatin은 cysteine proteinase inhibitor에 속하는 단백질로 항상성 유지, 염증 반응, 항체 생성, 암세포 전이, 면역반응, cathepsin-의존적 세포 사멸 등의 생체내의 생리학적 및 병원체에 관련된 다양한 생체공정에 관여하는 많은 단백질들이 이에 포함된다. 이러한 cystatin superfamily는 살아있는 모든 생물에서 존재하는 것으로 알려져 있다. Cystatin 중에서 cystatin B는 intracellular cysteine proteinases inhibitor로 papain과 같은 cysteine proteinase에 결합하여 그 활성을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, lysosome으로부터 유출된 proteinases로부터 보호 및 외부 침입으로부터 생물학적 방어에 관여하는 것으로 생각되고 있다. 상염색체 열성 질환인 신경성 발적의 원인인 cystatin B의 결함은 인간에서 근간대성경련, 강직간대 발작등을 일으킨다고 알려져 있으며, 이러한 이유로 경제적으로 중요한 해양 생물에서 면역학적 관점에서의 기능적 특성 및 구조분석을 통한 Cystatin B의 역할에 대한 이해는 매우 중요하다고 할 수 있다. 이 연구에서는 돌돔 (RbCyt B), 까막전복 (AbCyt B), 바지락 (McCyt B)으로부터 각각 cystatin B 유전자를 확인하였고, transcriptome 분석을 통하여 cDNA서열을 확인 하였고, BAC library를 제작하고 Cystatin을 포함하는 BAC clone의 Sequencing을 통하여 genomic DNA의 서열을 확인하였다. 돌돔과 까막전복의 genomic DNA 서열은 Spiedy를 이용하여 exon과 intron 및 구조를 확인하고 TF search online tool을 이용하여 프로모터 부위의 예상되는 Transcription factor 결합부위를 분석하였다. Complete cDNA 확인 하고 단백질 암호화 부위를 확인하였다. 이를 이용하여 다른 종의 cystatin B 단백질들과 ClustalW pairwise alignment와 sequence analysis를 수행하였다. Cystatin B의 orthologue간의 관계를 확인 하기 위하여 보고된 cystatin family의 아미노산 서열을 이용하여 계통분류학적 분석을 수행하였고, 구조 및 기능에 대한 이해를 위하여 I-TASSER sever for protein structure and function prediction 을 이영하여 3차원 구조 modeling을 수행하였다. 이 세 종으로부터 얻어진 cystatin 유전자의 단백질 암호화 부위를 pMAL-c2X expression vector에 cloning 하고 재조합 단백질의 overexpression 및 정제 후cysteine proteinase inhibitory assay를 수행하였다. 또한 quantitative real-rime RT-PCR을 통하여 조직특이적 발현과 면역 자극후의 발현변화를 관찰 하였다. RbCyt B와 AbCyt B의 genomic sequence는 프로모터 부위를 포함하여 약 3.85 Kb와 8.4 Kb를 나타내었다. RbCyt B와 AbCyt B의 Genomic 구조 분석은 다른 종의 cystatin에서 나타나는 특징처럼 3개의 exon과 2개의 intron으로 구성되어 있는 것을 확인하였다. RbCyt B와 AbCyt B 모두의 프로모터 부위에서 외부스트레스나 병원체 등에 의하여 활성화 되는 여러 전사인자 결합 부위를 찾을 수 있었다. RbCyt B의 cDNA 전체 서열 길이는 614 bp, AbCyt B는 1967 bp 그리고 McCyt B는 509 bp로 각각 300 bp, 303 bp, 297 bp 의 open reading frame (ORF)를 가지고 있어 각각 100, 101, 그리고 99개의 아미노산 서열을 암호화 하고 있다. 세 개의 모든 Cyst B 분자들은 type I cystatin 그룹에 속하는 시스테인 분해효소 억제자의 특징인 Glycine 잔기, QxVxG motif와 PW motif가 잘 보존된 conserved cystatin-like 도메인을 포함하고 있으며, 약 11 kDa 정도의 분자량을 가질 것으로 예측되었다. 또한 이 세 종으로부터 확인된 3개의 단백질 모두에서 type I cystatin에서 보여지는 전형적인 특징이 모두 관찰되었다. RbCyt B는 European sea bass와 가장 높은 identity와 similarity를 나타내었으며, AbCyt B와 McCyt B는 각각 human과 pacific oyster와 가장 높은 identity를 나타내었다. 계통분류학적 분석결과 이 연구에서 확인하고자 하는 RbCyt B, AbCyt B, McCyt B들은 다른 cystatin B 단백질들과 함께 그룹을 형성하는 결과를 나타내었으며, 돌돔의 cystatin B는 경골어류의 cystatin B와 그룹을 형성하였고, 까막전복과 바지락의 Cystatin B는 연체동물 군과 함께 그룹을 형성하였다. 3차원 구조 모형화를 통하여 Cystatin B의 stefin family proteinases의 전형적인 특징을 확인하였다. 특히 첫 번째 hairpin loop의 penta peptide conserved motif (QxVxG)와 PW motif, N-terminal 부위의 glycine 잔기는 papain-like cysteine protease의 active site에 highly compatible한 wedged-shaped edge 형태를 나타내었고, 이는 구조적, 기능적으로 cystatin B에 속함을 입증하고 있다. Cystatin B의 단백질 암호화 부위 서열을 pMAL-c2X expression vector에 클로닝하여 MBP와 fusion된 단백질을 발현시키고 생화확적 기능분석을 하였다. 돌돔,
v
까막전복 바지락의 세가지 재조합 단백질들은 azo-casein의 가수분해에 대한 papain의 proteolytic활성에 대하여 눈에 띄는 protease inhibitory activity를 보였다. Papain과 cystatin B가 1:1로 존재하는 상태에서 papain activity는 재조합 cystatin B에 의하여 80% 이상의 저해 활성을 나타내었다.
돌돔, 까막전복, 바지락으로부터 확인한 Cystatin B는 모든 조직에서 조직 특이적 발현이 관찰되었다. 돌돔에서는 다른 조직에 비하여 간, 비장, 아가미에서 유의적으로 많은 발현을 나타내었으며, 전복과 바지락에서는 hemocyte, 아가미, mantle 그리고 소화관에서 높은 발현을 나타내었다. 이는 외부와 자주 접촉하는 기관으로 미생물과의 잦은 접촉으로 인한 면역반응 조절에 따른 것으로 생각되었다.
하지만 박테리아와 pathogen associated molecules (PAMs)를 통한 면역 자극 후에는 면역조직에서 유의적인 발현 증가를 나타내었다. 돌돔의 신장과 비장에서는 Edwardsiella tarda의 감염에 따라 유의적인 발현 증가를 나타내었다. Vibrio parahaemolyticus를 처리한 전복과 Vibrio tapetis를 처리한 바지락에서 모두 아가미와 hemocyte에서 mRNA의 발현이 증가하는 것을 나타내었으나, 바지락에서는 LPS를 처리하였을 때 gill과 hemocyte 모두에서 발현량이 상대적으로 감소하는 결과를 나타내었다. Poly I:C를 처리한 바지락에서는 Cystatin B의 mRNA가 up-regulation과 down-regulation이 반복적으로 일어나는 복합적인 발현양상을 나타내었다.
결론적으로, 이 연구에서는 돌돔, 까막전복, 바지락의 세가지 종으로부터 획득한 cystatin B 분자의 비교분석에 의한 접근을 통하여 일반적인 구조와 기능적 특성이 진화적으로 잘 보존되어 있음을 확인 하였다. 이런 이유로, 이 연구는 면역학적 관점에서 경골어류와 해양 무척추동물의 세포생물학적인 cystatin B의 특성에 대한 이해를 하는데 매우 가치 있는 자료로 사용될 수 있을 것이다.
Author(s)
H.K. Ajith Premachandra
Issued Date
2013
Awarded Date
2013. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006226
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
이제희
Table Of Contents
1.INTRODUCTION 1
2.MATERIALS AND METHODS 11
2.1.Experimental animals 11
2.1.1.Rock bream (Oplegnathus fasciatus) 11
2.1.2.Disk abalone (Haliotis discus discus) 11
2.1.3.Manila clam (Ruditapes philippinarum) 11
2.2.Identification of cystatin B sequences from three species 12
2.3.Bacterial artificial chromosome (BAC) library construction and screening 13
2.4.In silico analysis of DNA and Protein sequences 14
2.5.Cloning and over-expression of recombinant cystatin Bs 15
2.6.Cysteine protease inhibition assay 16
2.7.Isolation of tissues from experimental animals 17
2.8.Immune challenge experiment for temporal mRNA expression analysis 18
2.9.Total RNA extraction and cDNA synthesis 19
2.10.Quantitative real-time PCR (qPCR) analysis 19
2.11.Statistical analysis 20
3.RESULTS 21
3.1.Identification and characterization of cystatin B sequences 21
3.2.In silico analysis and comparison of cystatin B sequences 24
3.2.1.Promoter region analysis 24
3.2.2.Genomic structure comparison 26
3.2.3.Pairwise and multiple sequence alignment analysis27
3.2.4.Computer based molecular modeling 29
3.3.Phylogenetic analysis of cystatin B 30
3.4.Over-expression and recombinant protein purification31
3.5. Cysteine protease inhibition assay 32
3.6.Tissue specific transcriptional profile of cystatin B 33
3.7.Immune-regulated transcriptional profile of cystatin B 35
4.DISCUSSION 40
CONCLUSIONS 50
REFERENCES 51
ACKNOWLEDGEMENT 61
Degree
Master
Publisher
제주대학교
Citation
H.K. Ajith Premachandra. (2013). COMPARATIVE ANALYSIS OF A CYSTEINE PROTEASE INHIBITOR, CYSTATIN B FROM ATELEOST Oplegnathus fasciatus AND TWO MOLLUSK SPECIES Haliotis discus discuss AND Ruditapes philippinarum
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