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Effects of Ecklonia cava on the growth of lactic acid bacteria and the improvement of innate immune response of olive flounder

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Abstract
사람이 생활하고 있는 지구에는 수많은 미생물들이 서식하고 있다. 자구상의 모든 생물들은 이러한 미생물들에게 오염되거나 함께 공존하면서 살아가고 있다. 사람도 예외 없이 태어나기 전 어머니의 뱃속에서부터 미생물과 함께 살아가고 있다. 이러한 미생물들은 대부분 사람과 직접적인 연관없이 살아가지만, 일부의 미생물은 사람에게 질병을 일으키기도 하고, 오히려 건강하게 살수 있도록 도움을 주면서 살아가기도 한다. 그 중에서도 사람이 태어나면서 외부(소화관, 구강, 인후, 코, 머리, 피부, 질 등)에 부착하여 살아가는 정상 미생물균총들은 병원 미생물과 달리 사람의 외부에서 유익균과 유해균으로 잘 균형을 이루어 정착해있다.
만약 병원미생물에 감염되어 유해균의 좋은 성장환경을 만들게 되면 감염증이 발생하기 쉽게되어 사람이 질병에 걸리게 되고, 반대로 우리가 먹는 음식 등을 통해서 유익균의 성장환경이 좋게 되면 병원균의 감염을 억제하고 성장을 방해하게 될 뿐만 아니라 우리 몸의 면역을 활성화시켜 질병의 발생을 억제한다. 그러므로 사람에게 유익균을 잘 정착하게 하고, 잘 정착한 유익균을 관리하면 다양한 질병의 발생을 억제 할 수 있다.
일찍이 메치니코프는 사람의 소화관에 유익균이 증가하게 되면 사람의 장수에 도움을 줄 수 있다고 주장했으며, 이러한 유익균이 많다는 것은 다르게 표현하면 우리몸에 유산균이 많다는 것을 전제로 한다. 건강에 유익한 유산균은 탄수화물을 이용하여 젖산(lactic acid) 등을 다량 생산하는 세균으로 단백질을 분해해서 부패시키는 능력은 없다. 이러한 유산균의 대부분은 편성혐기성성균(Obligate anaerobe) 또는 통성혐기성균(facultative anaerobe)인 Lactobacillus, Bifidobacterium 속 세균들이다.
이렇게 사람의 건강을 증진시키기 위해 장내 유산균을 늘리는 연구는 1800년대 후반부터 시작되었으며, 최근 기술발전과 사람 장내 미생물 군집에 대한 연구가 활발하게 이루어짐에 따라, 유산균 증식에 대한 연구도 다시 수면위로 부상하고 있다. 그 중 프로바이오틱스는 '살아있는 미생물로서 적정량을 섭취할 경우 숙주에 도움이 되어 건강효과를 주는 것'으로 정의 되고 있으며, 섭취 시 장에 정착하여 장내 미생물균총의 일부가 되어 pH와 같은 주요 장내 환경적인 요인을 조절하고 bacteriocins과 같은 항균 물질을 생산하여 장내 미생물균총의 구성에 상당한 영향을 줄 수 있다.
이러한 프로바이오틱스의 증식과 생존에 도움을 주는 요인들을 통틀어 프리바이오틱스라고 부른다. 현재까지 이러한 프리바이오틱스로 알려진 성분으로는 oligosaccharides (Fructo-oligosaccharides, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, Lactosucrose, Lactulose, Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides 등)와 식이섬유가 있다.이들은 주로 bifidogenic 요인으로서 불리워지며, bifidobacteria의 성장을 자극한다고 알려 있다.
한국의 남해안이나 제주 연안에 서식하고 있는 다시마목(Laminariales)의 다시마과(Alariaceae)에 속한 감태(Ecklonia cava)는 이미 이전 연구들을 통해서 혈압 및 혈중 콜레스테롤의 조정, 항염증, 면역활성 자극효능 및 항균이나 항산화, 항바이러스 같은 생리활성이 검증된 해조류이다. 하지만 추출물의 수율이 낮고, 추출하는 과정에서 많은 유효성분이 버려지고 있으며, 그 성분에 있어 대부분을 차지하는 알긴산이나 후코이단 같은 다당류의 특징상 인체흡수가 용이하지 못하다는 단점을 내포하고 있다. 이러한 문제점의 해결 방안으로 이번 연구에서는 다당류를 다량 함유한 해조류 감태의 유산균증식 효과를 증명하고 그 이차대사산물의 유해균을 억제활성을 평가하였다.
또한, 감태의 유산균 증식과 유해균 억제 효과를 바탕으로 감태가 양식넙치에미치는성장효과, 병원성미생물에대한 넙치 장내에서의프리바이오틱스 및사료첨가제로써의상업적가치를효과를 검증하여 기존에 연구된 단순 항생제 대신 유해 미생물 억제 효과와 생산성 향상을 동시에 갖고 있는 새로운 천연항생제의 가능성을 평가하고자 하였다.
먼저 제주도에 소재한 아쿠아그린텍㈜에서 구매한 총 6가지의 제주산 천연자원(감귤박, 당근박, 섬오가피, 우뭇가사리, 파래, 감태)을 1% 첨가한 배지에 프로바이오틱스로 가장 많이 사용되는 3종의 유산균(Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum)을 접종하여 유산균의 증식효과를 확인 하였다. 유산균의 증식 효과를 확인한 결과, 다른 5종의 천연물 자원과 비교하여 감태의 유산균 증식 효과가 3 ~ 3.5 배 이상 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 이렇게 높은 증식 효과를 보인 감태의 배지내 최적 첨가농도를 확인하기 위해서 배지 내 첨가 농도별(0, 0.01, 0.1, 1, 10 mg/ml)로 확인한 결과에서도 첨가 농도에 따라 증식효과가 늘어 났으며, 그중 가장 효율적으로 증식효과를 보인 1mg/ml를 최적 첨가 농도로 선정하였다. 더 다양한 유산균의 증식효과를 평가하기 위해 감태 원시료와 감태에서 추출한 4종(물 추출물, 효소 추출물, 50% 에탄올 추출물, 100% 에탄올 추출물)을 첨가한 배지에 프로바이오틱스로 많이 사용되는 3종(Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum)과 3종의 유산균(lactobacillus casei, lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus, lactobacillus reuteri)을 추가로 접종하여 증식효과를 확인하였다. 그 결과, 감태 원시료와 감태 효소 추출물이 가장 높은 증식 효과를 보여 주었고, 그 다음 감태 물추출물, 감태 50% 에탄올 추출물 순으로 증식효과가 보였으며, 감태 100% 에탄올 추출물은 증식효과가 미비하거나 없는 것으로 평가 되었다. 따라서 감태의 성분들 중 유산균을 증식 시키는 효과는 다당류 또는 단백질로 판단되어, 정확한 성분을 확인하기 위하여 5종의 당 분해효소와 5종의 단백질 분해효소를 사용하여 효소추출을 수행하였으며, 6종의 유산균 중, 실제 산업적으로 가장 많이 사용되며, 이미 사료 내 프로바이오틱스 제품으로 널리 쓰이는 Lactobacillus plantarum을 이용하여 이후, 연구를 수행하였다.
효소추출을 수행한 결과, 수율이 약 20%에서 40%까지 나타났으며, 10종의 효소추출물들이 모두 유산균을 증식시켰으며, 그 중 5종의 당분해효소 추출물들이 단백질 분해효소추출물들 보다 유산균 증식효과가 높다는 것을 확인하였고, 그 중에서도 Celluclast효소추출물이 가장 높은 증식효과를 보여 다음 실험을 위해 사용하였다.
Celluclast효소추출물로부터 유효성분을 좀 더 분리하기 위해 막분리 시스템을 이용하여 분리하였고, 얻어진 30kDa이상/이하의 분획물을 가지고 유산균을 증식을 확인하였다. 그 결과, 두 분획물 모두, 유산균을 증식 시켰으나, 30kDa이상의 분획물이 더 좋은 효과를 보였다. 그래서 30kDa이상의 분획물로부터 에탄올 분획법을 사용하여 다당류 성분을 침전시켜 분리하였다. 그 결과, 분리된 감태 유래 다당류 (E. cava Crude Polysaccharide: ECP)는 농도 의존적으로 유산균을 증식시켰다.
또한, 감태 원시료와 감태에서 추출한 4종(물 추출물, 효소 추출물, 50% 에탄올 추출물, 100% 에탄올 추출물)을 첨가한 배지에 어병균 5종(Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi, Streptococcus parauberis)을 접종하여 그 증식률을 확인한 결과, 감태 100% 에탄올 추출물에서 가장 우수한 어병균 증식 억제효과를 보인 것을 확인 할 수 있었다. 그 중 가장 높은 효과를 보인 3종(Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio harveyi)에서 배지 내 감태 100% 에탄올 추출물의 첨가 농도 별로 확인을 한 결과에서도, 농도의존적으로 상당하게 증식을 억제한 것을 확인 할 수 있었다.
감태로 증식된 유산균의 이차대사산물의 어병균 증식 억제 효과를 평가한 결과에서는 감태 원시료와 효소추출물이 첨가되어 증식된 유산균에서 생성된 이차대사산물이 어병균 3종(Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio harveyi)에 대해서 높은 증식 억제 효과를 보였다. 따라서 감태의 첨가가 유산균을 증식시키고 증식되는 과정에서 다량으로 생성되는 물질이 bacteriocins과 같은 항균물질인 것으로 확인 되었다.
따라서, 이러한 감태의 첨가 효과를 바탕으로 사료내 감태를 첨가하여 넙치 사양시험을 수행하였다. 사양실험은 표선에 위치한 만해수산에서 300~350 g의 넙치를 이용하여 수행하였으며, 12개의 수조에 각각 1,800마리의 넙치를 순치한 후, 3개의 수조마다 각각 다른 사료(감태 1%첨가, 감태 에탄올 추출물 0.1% 첨가, 감태 에탄올 추출물 0.5% 첨가)를 제작하여 16주간 실험하였다.
사료 내 감태 1% 첨가는넙치성장에유의적인효과를나타내었으며사료에대한적정첨가농도는 1%였다. 한편, 감태 에탄올 추출물 0.5% 첨가 사료를섭이한넙치에서는감태 1% 첨가 사료보다낮은성장을보였다. 이러한결과는감태 1% 첨가 사료가일반사료 및 다른 첨가 사료에비해서양식넙치의성장에효과적인것으로보이며따라서감태 1% 첨가 사료는양식넙치의성장및사료효율개선에효과적인사료첨가제로사료된다. 또한감태 1% 첨가 사료를 섭이한 넙치의 혈액을 분석한 결과, GOT, GPT 값은낮아지고 Hematocrit 값은 높아졌으며, NBT활성, 라이소자임 활성, MPO활성은 일반사료를 먹은 넙치에 비해 크게 증가하는 것을 보였다. 이로써, 감태 1% 첨가 사료는 넙치의 면역력개선에효과적으로작용하는것으로생각된다.
그러므로, 감태 1% 첨가 사료로 섭이한 넙치가 갖는 면역증강 능력을 확인 하기 위해, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio harveyi를 접종하여 공격실험을 수행한 하였다. 접종 후 2주간의 폐사율을 측정한 결과, 감태 1% 첨가 사료로 섭이한 넙치가대조구에비해낮은사망률을보였다. 이는감태의 첨가로 인해 증가한 유산균의길항특성(probiotics)으로양식넙치에있어서면역력을증가시키고생존율을높이는것으로판단 된다.
제주에서 다량 발생하는 해조류인 감태는 시판되고있는양식사료첨가제인키토산, 베타글루칸그리고어보산에비해 가공단계가 적고, 건조나 사료 내 첨가에 있어 활용이 원활하여, 다른사료첨가제들에비해양식사료첨가제로써상대적으로효과가좋은것으로사료된다.
지금까지의 결과를 통해 감태는 프리바이오틱스로서 유산균의 대량 증식을 도우며, 사료 내에 첨가 시 어류의 성장과 면역력을 크게 증가 시킨다는 것을 확인 할 수 있었다. 이것은 제주에서 나는 감태가 연구적인 가치뿐만이 아니라 산업적으로도 유용될 수 있다는 사실을 이번 연구를 통해 다시 한번 확인하였다
Author(s)
이원우
Issued Date
2013
Awarded Date
2013. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006496
Alternative Author(s)
Lee, Won Woo
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
You-Jin Jeon
Table Of Contents
Part 1.Effect of Ecklonia cava on the growth of lactic acid bacteria (LAB) and pathogen bacteria.
ABSTRACT 2
INTRODUCTION 3
MATERIALS AND METHODS 6
Preparation of samples 6
Preparation of ethanol, aqueous, and enzymatic extracts from E. cava 6
Preparation of molecular weight fractionsfromCelluclast extract of E. cava. 7
Isolation of a polysaccharide from > 30 kDa fraction of E. cavaCelluclast extract 7
LAB culture 7
Pathogen bacteria culture 8
Colony count assay 8
Statistical analysis 9
RESULTS 12
The original E. cava showed the highest growth effect on the growth of LAB 12
The Celluclastextract of E. cava showed the highest effects on the growth of L. plantarum 15
The >30 kDa fraction from the Celluclastextract of E. cava markedly increased the growth of L. plantarum 18
The crude polysaccharide isolated from >30 kDa fraction of the E. cava Celluclastextract markedly and dose-dependently increased the growth of L. plantarum 18
The originalE. cava, Celluclast and 100% ethanol extracts showed anti-bacteria activities on pathogen bacteria 21
The originalE. cava improved the production of the secondary metabolites from L. plantarum in MRS medium 25
The secondary metabolites produced by the originalE. cava from L. plantarumin MRS mediumshowed the anti-bacterial activities on pathogen bacteria 28
DISCUSSION 31
Part 2.Effect of Ecklonia cava on the growth and host immune response in in vivo system.
ABSTRACT 35
INTRODUCTION 36
MATERIALS AND METHODS 39
Preparation of samples 39
Preparation of ethanol extracts from E. cava (EPE) 39
Pathogen bacteria culture 39
Preparation of the original E. cava, EPS, and L. plantarum supplemented diets 41
Fish 41
Body weight and mortality measurement 42
Blood sampling 42
Physiological and chemical analysis of blood 42
Nitroblue tetrazolium reduction analysis (NBT) 43
Lysozyme activity 43
Myeloperoxidase (MPO) assay 44
Challenge test 45
Polymerase ChainReaction (PCR) 45
Statistical analysis 47
RESULTS 48
DISCUSSION 64
REFERENCES 68
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
이원우. (2013). Effects of Ecklonia cava on the growth of lactic acid bacteria and the improvement of innate immune response of olive flounder
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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