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MOLECULAR INSIGHTS INTO SELECTIVE INNATE ANTIVIRAL SIGNALING MECHANISM IN ROCK BREAM, Oplegnathus fasciatus

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Abstract
돌돔(영명: Rockbream, 학명: Oplegnathus fasciatus)은 한국과 일본에서 중요한 수산 자원 중 하나이다. 그러나 현재 돌돔양식업에서 질병으로 인한 높은 폐사율과 경제적 손실이 일어나고 있기 때문에 이에 대한 대책을 위해서는 어류숙주와 병원균간의 상호작용 및 그에 따른 숙주의 반응에 대한 이해가 절실한 실정이다. 이러한 질병이 없는 상태를 유지하기 위해서는 질병과 스트레스를 관리할 수 있는 기술이 필요하다. 따라서 돌돔의 면역체계를 이해하는 것은 어류질병에 대응하기 위한 새로운 전략의 발전에 도움이 될 것이다.
1장에서는 dsRNA 바이러스를 인식 할 수 있는 분자인식수용체(pattern recognition protein, PRR) 중 하나인 melanoma differentiation associated 5 (MDA5) 에 대하여 동정 연구에 대해서 논하고자 한다. 유전체 구성과 단백질 구조 분석, 어류의 조직특이적 및 감염과 시간에 따른 유전자 발현양상 및 재조합단백질의 항바이러스 활성에 대해 연구하였다. MDA5 는 세포질에 존재하는 단백질로 retinoic acid inducible gene I (RIG-I)과 같은 다른 PRR과 유사한 구조를 지녔다. 돌돔의 MDA5 유전자(RbMDA5)의 cDNA를 분석한 결과, 992개의 아미노산을 지정하는 2976 bp의 open reading frame(ORF)을 지닌 분자량 112 kDa의 단백질로 나타났다. RbMDA5의 유전체는 16개의 exon과 15의 intron을 지녔으며 AP-1, AP-4, IRF-1, IRF-2, c-Rel, Lyf-1, Sp1, Oct-1, ISRE 및 AML-1a과 같은 전사인자결합 부위를 찾아내었다. RbMDA5 단백질은 2개의 N-말단 CARD domain과 ResIII site, central DExD/H box RNA helicase domain, MDA5 insert domain, HELIc domain이 있었고, C-말단 서열에서는 RIG-I_C-RD [(C-terminal repressor domain(RD)]가 조사되었다. 6개의 helicase motif와 RNA 결합 loop 또한 존재하는 것으로 나타났다. RbMDA5는 orange spotted grouper의 MDA5와 가장 높은 identity를 보였다. 다양한 조직에서와 면역원자극실험을 한 후의 정량 RT-PCR를 수행하여 유전자 발현을 분석한 결과, 조직분석에서는 다양한 조직에서 발현이 됨을 확인하였고 특히 혈구에서 가장 높은 발현을 보였으며 간에서는 그 다음의 높은 발현이 나타나는 것을 확인하였다. Poly I:C를 주입하여 면역자극을 유도하여 아가미(gill)와 비장(spleen), 두신장(head kidney) 및 혈구(blood)에서 발현량은 상향 발현조절이 이루어짐을 확인하였다. 돌돔의 심장 세포를 이용하여 RbMDA5 유전자의 발현을 유도한 결과 marine birnavirus의 감염을 억제하는 것으로 나타나 돌돔의 MDA5는 바이러스 감염에 대한 면역반응에 관여하는 것으로 여겨졌다.
2장에서는 또 다른 분자인식수용체인 Laboratory of Genetics and Physiology2 (LGP2)에 대해 동정한 연구에 대해 논하고자 한다. LGP2 역시 1장에서 논한 MDA5와 마찬가지로 바이러스의 dsRNA를 인식하는 세포질 내에 존재하는 분자인식수용체로 바이러스의 특이적인 분자를 인식하여 바이러스 감염에 관련된 신호전달에 역할을 수행한다. 돌돔LGP2(RbLGP2)의 cDNA를 분석한 결과, 681개의 아미노산을 지정하는 2043 bp의 open reading frame(ORF)을 지닌 분자량 77 kDa의 단백질로 나타났다. RbMDA5의 유전체는 12개의 exon과 11의 intron을 지녔으며 AP-1, AP-4, IRF-1, IRF-2, CRE-BP, Oct-1, HSF 및 AML-1a과 같은 RbLGP2유전자의 발현에 관여하는 전사인자결합 부위를 찾아내었다. RbLGP2는 하나의 DExDc(DEAD/DEAH box helicase domain)을 N-말단 서열에서 확인되었으며, RIG-I_C-RD (C-terminal domain of RIG-I/ regulatory domain/ repressor domain) alc ResIII region, MDA4_ID (insert domain of MDA5 helicase and similar proteins) 및 RNA 결합 loop가 존재함을 확인하였다. 또한 두 개의 zinc binding motif를 지닌 것으로 나타났다. 또한 단백질 구조 분석 결과 RNA helicase 활성에 관여하는 DEDxD/H box와 같은 특징적인 6개의 motif가 존재함을 확인하였다. Pairwise alignment 결과 넙치(olive flounder)의 LGP2와 가장 높은 identity와 similarity(각각 79 %, 90%)로 나타났다. 정량 RT-PCR를 이용한 조직별 유전자 발현 분석 결과, RbMDA5와 유사한 패턴으로 혈구와 간에서 높은 발현을 하는 것으로 나타났다. Poly I:C를 주입하여 면역자극을 유도하여 아가미(gill)와 비장(spleen), 두신장(head kidney) 및 혈구(blood)에서 발현량은 상향 발현조절이 이루어짐이 나타남에 따라 바이러스감염에 RbLGP2는 바이러스 감염에 따른 활성이 있는 것으로 여겨진다. 재조합단백질을 이용하여 항바이러스 활성을 조사한 실험에서는 marine birnavirus 감염을 억제하는 것으로 나타나 RbLGP2는 돌돔의 선천면역계에 있어 바이러스 감염에 따른 면역활성이 있는 것으로 여겨진다.
3장에서는 IFN-β promoter stimulator-1(IPS-1) 혹은 VISA, Cardif라 알려진 Mitochondrial antiviral signaling protein(MAVS)에 대한 동정연구에 대해 논하고자 한다. MAVS는 RIG-I/MDA5 경로에서 핵심적인 역할을 수행하는 단백질로 interferons(IFNs)와 다른 cytokine들을 유도한다. 돌돔MAVS(RbMAVS) cDNA를 분석한 결과, 586개의 아미노산을 지정하는 1758 bp의 open reading frame(ORF)을 지닌 분자량 62 kDa의 단백질로 나타났다. RbMAVS의 단백질은 CARD domain을 지닌 것으로 나타났고, proline rich domain 및 transmembrane domain을 지닌 것으로 조사되었다. RbMAVS 단백질은 또한 TRAF2 결합 motif 인 PVQDT 가 319-323 사이의 아미노산 잔기서열에 존재함을 확인하였다. RbMAVS 단백질 서열은 전체 단백질 서열과 CARD domain의 서열을 다른 종의 MAVS 단백질 서열과 비교한 결과 넙치에서 가장 높은 identity와 similarity를 공유하는 것으로 조사되었다. 정량 RT-PCR를 이용한 조직별 유전자 발현 분석 결과, 다양한 조직에서 발현이 되지만 특히 혈구에서 가장 높은 발현이 나타남을 확인하였고 그 다음 간에서 높은 발현을 하는 것으로 나타났다. Poly I:C를 주입하여 면역자극을 유도하여 아가미(gill)와 비장(spleen), 두신장(head kidney) 및 혈구(blood)에서 발현량은 상향 발현조절이 이루어짐이 나타남에 따라 바이러스감염에 RbMAVS 역시 바이러스 감염에 따른 활성이 있는 것으로 여겨진다. 또한 In vitro 상에서 overexpression 한 결과, 바이러스의 복제를 억제하는 것으로 나타나 돌돔의 항바이러스면역계에 관여하는 단백질임을 추정하였다.
TBK1과 IKKε 은 비-양이온성 kinase 가계에 속하는 유전자로 특이적인 면역효과 분자들의 전사를 유도하는 인자들의 phosphorylation에 역할을 함으로써 면역방어기전에 관여하는 것으로 알려져 있다. 돌돔 TBK1(RbTBK1)의 cDNA를 분석한 결과, 723개의 아미노산을 지정하는 2169 bp의 open reading frame(ORF)을 지닌 분자량 83 kDa의 단백질로 나타났다. RbIKKε의 cDNA는 721개의 아미노산을 지정하는 2169 bp의 서열을 지닌 것으로 나타났으며 단백질의 분자량은 82 kDa을 지닌 것으로 조사되었다. RbTBK1 과 RbIKKε의 단백질은 N-말단 서열에서 보존된 protein kinase(PK), catalytic (c) domain (PKc domain)을 지닌 것으로 나타났다 (RbTBK1: 15-293 아미노산잔기서열, RbIKKε: 19-327 아미노산잔기서열). 두 단백질은 ubiquitin-like domain (RbTBK1: 297-385 아미노산잔기서열, RbIKKε: 300-388 아미노산잔기서열)이 존재함으로써 kinase 가계에 속하는 단백질임을 확인하였다. RbTBK1은 nile tilapia와 가장 높은 identity 와 similarity (각각 96% 및 98%)를 지님이 나타났고 또한 인간과 쥐의 TBK1과 70%의 identity를 보였다. RbIKKε은 nile tilapia에서 가장 높은 상동성을 지님이 나타났고(86%) similarity의 경우 nile tilapia 뿐만 아니라 Zebra Mbuna와 함께 높은 값을 나타내었다 (94%). RbTBK1의 유전체 구조는 21개의 exon과 20개의 intron이 존재하는 것으로 나타났다. RbTBK1와 RbIKKε유전자의 조직별 발현 분석결과 RbTBK1의 경우 혈구에서 가장 높고 그 다음 간인 반면, RbIKKε은 간에서 가장 높은 발현이 있었고 그 다음 혈구로 나타났다. Poly I:C 감염시간에 따른 유전자발현 조사결과 간과 두신장이 현저하게 발현이 되는 것으로 나타나 바이러스 감염에 RbTBK1와 RbIKKε는 면역체계에 관여하는 것으로 여겨진다.
전사인자는 IFN과 IFN-자극유전자의 발현을 조절하는 중심적인 역할을 하는 단백질이다. IRF3와 IRF7은 이러한 제 1형 IFN과 ISG 유전자의 전사활성에 있어 중요한 역할을 수행한다. IRF3는 본질적으로 세포질 내에서 비활성화 상태로 존재한다. 그러다 바이러스 감염시에는 조절 부위가 인산화되면서 이형체를 형성한다(dimerization). 돌돔 IRF3(RbIRF3)의 cDNA를 분석한 결과, 462개의 아미노산을 지정하는 1368 bp의 open reading frame(ORF)을 지닌 분자량 51 kDa의 단백질로 나타났다. In silico 를 통한 동정분석에서는 RbIRF3는 보존된 IRF tryptophan pentad repeat DNA-binding domain(DBD)를 N-말단 서열에 지니고 있음이 조사되었다. 한편 C-말단 서열에서는 다른 종에서 유래한 IRF3 단백질에 존재하는 IRF-associated domain(IAD) 와 serine-rich domain이 존재함을 확인하였다. Pairwise alignment 결과 Dicentrarchus labrax와 가장 높은 identity 와 similarity를 가짐을 확인하였다 (각각 87%, 92%). 유전체 구조 분석 결과 11개의 exon과 10개의 intron의 구조로 이루어진 유전체임을 확인하였고 넙치와 가장 가까운 homology를 지녔음이 조사되었다. 프로모터 예측 조사 결과 AP-1, AP-4, C/EBP-α,-β, Lyf-1, HSF, Sp1, Oct-1, Sox-5, E2F, RORα, AML-1a, GATA-1 등 다양한 자극에 관여하는 전사인자결합site가 발견되었다. 조직에 따른 유전자의 발현양상을 qRT-PCR을 이용해 조사한 결과 간에서 가장 높은 발현이 나타났고 그 다음은 피부(skin)에서 발현함을 확인하였다. Poly I:C 주입을 통한 감염실험 결과 혈구 및 간, 두신부에서 상향조절이 됨이 나타나, 위의 결과들을 종합하여 RbIRF3는 숙주의 항바이러스 면역체계에 관여하는 것으로 여겨진다.
이 논문에서는 돌돔의 항바이러스 면역신호체계에 관련하는 몇 가지 유전자와 단백질들에 대해 동정하였다. 유전자 발현양상 조사와 각 분자간의 상호작용에 관한 조사는 바이러스 병원체에 대항하여 어류가 생존할 수 있는 전략을 세우는데 도움이 될 것이다.
Rock bream (Oplegnathus fasciatus), is an important delicacy in Korea and Japan. High mortality rates and economic losses in aquaculture urge the need for understanding fish-pathogen interactions and fish responses against microbes to fight back the diseases. In order to develop a sustained disease free-state of art rock bream aquaculture, techniques are needed to combat disease and stress related mortalities. Immune defense mechanism of rock bream is to be well understood in order to develop novel strategies to prevent diseases and improve the sustainability of rock bream.
In the first part of this study, a pattern recognition receptor, melanoma differentiation associated 5, involved in the recognition of dsRNA viruses, is characterized. The genome organization, protein structure analysis, spatial and temporal expression analysis, and antiviral activity of the recombinant protein have been demonstrated. MDA5 is a cytosol residing protein which is structurally similar to another PRR namely, retinoic acid inducible gene I (RIG-I). Rock bream MDA5 (RbMDA5) cDNA possessed an open reading frame (ORF) of 2976 bp, coding for 992 amino acids with molecular mass of 112 kDa. RbMDA5 genome possessed 16 exons split by 15 introns and putative promoter analysis revealed significant transcription factor binding sites like AP-1, AP-4, IRF-1 and 2, c-Rel, Lyf-1, Sp1, Oct-1, ISRE and AML-1a. RbMDA5 protein possessed two N-terminal CARD regions, a ResIII site, a central DExD/H box RNA helicase domain, an MDA5 insert domain, a HELIc domain, a RIG-I_C-RD (C-terminal repressor domain (RD) embedded within the C-terminal domain (CTD). There were six helicase motifs and an RNA binding loop present in RbMDA5. RbMDA5 shared highest identity with orange spotted grouper MDA5. Quantitative RT-PCR was employed to analyze the mRNA expression in the normal and challenged tissues. RbMDA5 mRNA was ubiquitously expressed in all the analyzed tissues obtained from healthy rock bream with the highest expression in blood, followed by liver. RbMDA5 mRNA expression in vivo was elevated upon poly I:C challenge in gill, liver, spleen, head kidney and blood. Overexpression of RbMDA5 in rock bream heart cells prevented marine birnavirus infection, thus confirming the innate immune antiviral defense role of MDA5.
In the second part of the study, a second PRR, Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2), was characterized. LGP2 is also a cytosol residing protein involved in both the recognition of viral dsRNA and regulation of the viral PAMP recognition and downstream signaling pathway. Rock bream LGP2 (RbLGP2) cDNA possessed an ORF of 2043 bp coding for 681 amino acids with molecular mass of 77 kDa. RbLGP2 genome derived from the BAC clone revealed a 12 exon-11 intron structure. Putative promoter analysis revealed various significant transcription factor binding sites like AP-1, AP-4, IRF-1 and 2, CRE-BP, Oct-1, HSF and AML-1a which may play a vital role in the regulation of RbLGP2 expression. RbLGP2 possessed one DExDc (DEAD/DEAH box helicase domain) in the N-terminal region, one ResIII region, one HELICc (helicase superfamily c-terminal domain), RIG-I_C-RD (C-terminal domain of RIG-I/ regulatory domain/ repressor domain), one MDA5_ID (insert domain of MDA5 helicase and similar proteins), RNA binding loop. There were two predicted zinc binding motifs. RbLGP2 protein portrayed the presence of six significant motifs including DEDxD/H box for RNA helicase activity. Pairwise alignment of RbLGP2 shared highest identity and similarity of 79 and 90%, respectively with the olive flounder LGP2. Quantitative RT-PCR analysis of tissues isolated from normal healthy rock bream fish revealed ubiquitous expression of RbLGP2 with highest expression in blood followed by liver, similar to the rock bream MDA5 expression. RbLGP2 expression analysis after poly I:C challenge in vivo, revealed significant elevation in tissues including gill, liver, head kidney, spleen and blood, suggesting their activation upon viral encounter. Overexpression of the recombinant RbLGP2 protein in vitro prevented marine birnavirus infection, further affirming the antiviral role of RbLGP2 in rock bream innate immune system.
In the third part of this thesis, Mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS), also known as IFN-β promoter stimulator-1 (IPS-1), VISA and Cardif, is a mitochondrial adaptor protein which plays a key role in the signal transduction of the RIG-I/MDA5 pathway to induce the production of interferons (IFNs) and other cytokines was characterized. Rock bream MAVS (RbMAVS) cDNA possessed an ORF of 1758 bp coding for a protein of 586 amino acids with molecular mass of 62 kDa. RbMAVS protein analysis revealed a CARD domain, a proline rich domain and a transmembrane domain. RbMAVS protein also possessed a putative TRAF2 binding motif, 319PVQDT323. RbMAVS shared the highest identity and similarity with the flounder MAVS homologue when the full protein and CARD region were compared. Spatial expression analysis performed with multiple tissues isolated from healthy rock bream using quantitative RT-PCR revealed ubiquitous expression of RbMAVS with maximum level of expression observed in blood, followed by liver. After poly I:C challenge in vivo, RbMAVS mRNA were elevated in various tissues like blood, liver, spleen and head kidney suggesting their upregulation during a viral attack. In vitro overexpression of RbMAVS inhibited viral replication suggesting its function of antiviral defense in rock bream.
TBK1 and IKK? are non-canonical kinase family members involved in immune defense mechanism through phosphorylation of transcription factors which drive the transcription of significant effector molecules. Rock bream (TBK1) cDNA possessed an ORF of 2169 bp coding for 723 amino acids with molecular mas of 83 kDa. RbIKK? cDNA possessed an ORF of 2163 bp coding for 721 amino acids with molecular mass of 82 kDa. RbTBK1 and RbIKK? protein revealed the presence of conserved protein kinases (PK), catalytic (c) domain (PKc domain) in their N -terminal region [(RbTBK1: residues 15-293) and (RbIKK?: residues 19-327)]. Both the protein revealed ubiquitin-like domain [(RbTBK1: residues 297-385) and (RbIKK?: residues 300-388)], characteristic of the similar kinase family proteins. RbTBK1 shared the highest identity with predicted TBK1 protein of Nile tilapia (identity 96% and similarity 98%) and more than 70% identity with that of human and mouse TBK1. RbIKK? shared the highest identity with IKK? homologue of Nile tilapia (86%) and similar percentage of similarity with Zebra Mbuna and Nile tilapia (94%). RbTBK1 genome possessed 21 exons intervened by 20 introns. Tissue distribution analysis of RbTBK1 and RbIKK? in tissues isolated from normal unchallenged rock bream revealed ubiquitous presence of RbTBK1 and RbIKK? in all the examined tissues. RbTBK1 was highly expressed in blood followed by liver. RbIKK? was detected most in liver followed by blood. Temporal modifications of RbTBK1 and RbIKK? expression could be observed post poly I:C challenge in liver and head kidney, suggesting their significant regulation during a viral encounter.
Transcription factors are a family of proteins which play a pivotal role in the regulation of expression of IFNs and IFN-stimulated genes. IRF3 and IRF7 play a crucial role in the transcriptional activation of type I IFN and ISGs. IRF3 is constitutively expressed in the cytosol in latent form. Upon viral infection, it undergoes phosphorylation at key serine residues in the regulatory domain and dimerization. Rock bream IRF3 (RbIRF3) cDNA consists of an ORF of 1386 bp coding for a protein of 462 amino acids with molecular mass of 51 kDa. In silico characterization of the RbIRF3 protein revealed the conserved IRF tryptophan pentad repeat DNA-binding domain (DBD) at the N-terminal region, an IRF-associated domain (IAD) and a serine-rich domain at the C-terminal region, similar to the other IRF3 proteins. Pairwise alignment showed that RbIRF3 had the highest identity and similarity of 87 and 92%, respectively with Dicentrarchus labrax. The genomic structure of RbIRF3 derived from the BAC clone revealed 11 exon -10 intron structural organizations, revealing closer homology to Japanese flounder IRF3. Putative promoter analysis revealed various transcription factor binding sites namely AP-1, AP-4, C/EBP -α and -??? Lyf-1, HSF, Sp1, Oct-1 Sox-5, E2F, RORα, AML-1a, GATA-1, suggesting their regulation upon various stimuli. Tissue distribution profiling of RbIRF3 performed in 11 different tissues isolated from healthy rock bream maintained under normal conditions using quantitative RT-PCR revealed ubiquitous expression with highest expression in liver, followed by skin. The kinetic transcriptional pattern of RbIRF3 analyzed by RT-PCR from blood, liver and head kidney isolated from rock bream following in vivo challenge with poly I:C revealed up-regulation during different phases of the experiment. The conservation of the domains coupled with the temporal modifications of RbIRF3 suggests its active involvement in antiviral defense of rock bream.
Finally, the genes involved in selected antiviral signaling pathway of rock bream, Oplegnathus fasciatus have been identified and characterized. The modulations of gene expression and their coordinated function together can combat the viral infection and help in the survival of the organism against the pathogenic threats
Author(s)
Saranya Revathy. K
Issued Date
2013
Awarded Date
2013. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006497
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
Jehee Lee
Table Of Contents
1.0 An introduction to innate antiviral signaling mechanisms in fish 2
General introduction 2
1.1 Aquaculture and viruses infecting fish aquaculture 2
1.1.1 Aquaculture 2
1.1.2 Fish viruses 4
1.2 Antiviral immunity in fish 9
1.2.1 Antiviral signaling in mammals 9
1.2.2 Cytosolic sensors and interferon production in mammals 11
1.2.3 Interferon system in mammals 13
1.2.4 Recognition of double stranded (ds) RNA in mammals and IFN induction 14
1.2.5 Antiviral signaling in teleosts 15
1.2.6 Interferon system in teleosts 16
1.2.7 IFN signaling pathways in fish 17
1.3 Aims of this work 19
2.0 Characterization of cytosolic sensor Melanoma Differentiation Associated gene 5 (MDA5) 21
Abstract 21
2.1 Introduction 22
2.2 Materials and methods 24
2.2.1 Animal rearing, cDNA library construction and RbMDA5 gene identification 24
2.2.2 BAC library creation and identification of RbMDA5 BAC clone 25
2.2.3 Sequence characterization, genome structure and phylogenetic analysis of RbMDA5 26
2.2.4 Transcriptional profile of RbMDA5 gene in challenged and normal tissues 27
2.2.4.1 Poly I:C challenge 27
2.2.4.2 RNA isolation and cDNA synthesis 27
2.2.4.3 Tissue distribution 28
2.2.4.4 Temporal RbMDA5 mRNA expression analysis post poly I:C challenge 29
2.2.5 Construction of expression vector and antiviral assay 29
2.2.5.1 Cell lines and viruses 29
2.2.5.2 Construction of expression vector 30
2.2.5.3 Antiviral assays 30
2.3 Results 31
2.3.1 RbMDA5 identification, sequence characterization, phylogenetic analysis 31
2.3.2 Genomic characterization of RbMDA5 37
2.3.3 Promoter analysis of RbMDA5 40
2.3.4 Spatial expression analysis of RbMDA5 41
2.3.5 Temporal expression analysis of RbMDA5 after poly I:C challenge 42
2.3.6 Antiviral activity of RbMDA5 44
2.4 Discussion 44
3.0 Characterization of the cytosolic sensor Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2) 50
Abstract 50
3.1 Introduction 51
3.2 Materials and methods 53
3.2.1 Animal rearing, cDNA library construction and RbLGP2 gene identification 53
3.2.2 BAC library creation and identification of RbLGP2 BAC clone 54
3.2.3 Sequence characterization, genome structure and phylogenetic analysis of RbLGP2 55
3.2.4 Transcriptional profile of RbLGP2 gene in challenged and normal tissues 56
3.2.4.1 Poly I:C challenge 56
3.2.4.2 RNA isolation and cDNA synthesis 56
3.2.4.3 Tissue distribution 57
3.2.4.4 Temporal RbLGP2 mRNA expression analysis post poly I:C challenge 58
3.2.5 Construction of expression vector and antiviral assay 58
3.2.5.1 Cell lines and viruses 58
3.2.5.2 Construction of expression vector 59
3.2.5.3 Antiviral assays 60
3.3 Results 60
3.3.1 RbLGP2 identification, sequence characterization and phylogenetic analysis 60
3.3.2 Genomic characterization of RbLGP2 66
3.3.3 Promoter analysis of RbLGP2 68
3.3.4 Spatial expression analysis of RbLGP2 70
3.3.5 RbLGP2 temporal expression analysis post poly I:C challenge 70
3.3.6 Antiviral assays 71
3.4 Discussion 72
4.0 Characterization of the signaling adaptor Mitochondrial AntiViral Signaling protein (MAVS) 80
Abstract 80
4.1 Introduction 81
4.2 Materials and methods 83
4.2.1Animal rearing, cDNA library construction and RbMAVS gene identification 83
4.2.2 Sequence characterization, genome structure and phylogenetic analysis of RbMAVS 84
4.2.3 Transcriptional profile of RbMAVS gene in challenged and normal tissues 84
4.2.3.1 Poly I:C challenge 84
4.2.3.2 RNA isolation and cDNA synthesis 85
4.2.3.3 Tissue distribution 85
4.2.3.4 Temporal RbMAVS mRNA expression analysis post poly I:C challenge 86
4.3 Construction of expression vector and antiviral assay 87
4.3.1 Cell lines and viruses 87
4.3.2 Construction of expression vector 88
4.3.3 Antiviral assays 88
4.4 Results 89
4.4.1 RbMAVS identification, sequence characterization and phylogenetic analysis 89
4.4.2 Spatial expression of RbMAVS in normal tissues 92
4.4.3 Temporal expression of RbMAVS after poly I:C challenge 93
4.4.4 Antiviral activity of RbMAVS 94
4.5 Discussion 94
5.0 Characterization of the non-canonical kinases TBK1 and IKK 100
Abstract 100
5.1 Introduction 101
5.2 Materials and methods 102
5.2.1 Animal rearing, cDNA library construction and RbTBK1 and RbIKK gene identification 102
5.2.2 BAC library creation and identification of RbTBK1 BAC clone 103
5.2.3 Sequence characterization and phylogenetic analysis of RbTBK1 and RbIKK 104
5.2.4 Transcriptional profile of RbTBK1 and RbIKK? gene in challenged and normal tissues 104
5.2.4.1 Poly I:C challenge 104
5.2.4.2 RNA isolation and cDNA synthesis 105
5.2.4.3 Tissue distribution 105
5.2.4.4 Temporal RbTBK1 mRNA expression analysis post poly I:C challenge 106
5.3 Results 107
5.3.1 Sequence characterization of RbTBK1 and RbIKK 107
5.3.2 Genome characterization of RbTBK1 115
5.3.4 Temporal expression analysis post poly I:C challenge 118
5.4 Discussion 119
6.0 Characterization of Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) 124
Abstract 124
6.1 Introduction 125
6.2 Materials and methods 127
6.2.1 Animal rearing, cDNA library construction and RbIRF3 gene identification 127
6.2.2 BAC library creation and identification of BAC clone 128
6.2.3 Sequence characterization and phylogenetic analysis of RbIRF3 129
6.2.4 Expression profile of RbIRF3 gene in normal and challenged tissues 130
6.2.4.1 Poly I:C challenge 130
6.2.4.2 RNA isolation and cDNA synthesis 130
6.2.4.3 Tissue distribution 131
6.2.4.4 Temporal RbIRF3 mRNA expression analysis post immune challenges 131
6.3 Results 132
6.3.1 Sequence characterization and phylogenetic analysis of RbIRF3 132
6.3.2 Genomic characterization of RbRIF3 139
6.3.3 Promoter analysis of RbIRF3 140
6.3.5 Tissue distribution of RbIRF3 142
6.3.6 Temporal expression post immune challenges 143
6.4 Discussion 144
7.0 References 148
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
Saranya Revathy. K. (2013). MOLECULAR INSIGHTS INTO SELECTIVE INNATE ANTIVIRAL SIGNALING MECHANISM IN ROCK BREAM, Oplegnathus fasciatus
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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