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제주 연안에서 분리한 해양유래 방선균 Streptomyces carpaticus MK-01의 형태학적·생화학적 동정 및 어류질병균주에 대한 항균활성탐색

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Alternative Title
Isolation and anti-bacterial effect of marine-dervied actinomycete -
Abstract
In this study, actinomycetes were isolated from seawater collected from Daejeong-coast of Jeju Island, to evaluate its antibacterial activity against fish pathogens. About 24 actinomycetes strains were isolated and identified using physiological, biochemical and molecular tools. Light microscopic observation of MK-01 strains hows gray spores bearing darkbrown mycelia colony which produce purple pigment. MK-01strain was found to have extensive antibacterial activity against S. iniae, S. parauberis, V.anguillarum, E. tarda. The optimum culture condition such as temperature, pH and NaCl(%) concentration required pH 6~7, 30℃ and 2% respectively.
The results of biochemical and physiochemical studies revealed that the best carbon source, organic nitrogen source and mineral source for cell growth and antibacterial activity are dextrose, tryptone, and MgSO4·7H2O respectively. Ethyl acetate and Methanol treated fractions of MK-01 culture supernatant were used for the antibacterial assay.
Minimum inhibitory concentration (MIC) of Methanol and Ethyl acetated fractions were about 31.25 ㎍/㎖ 32.5 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖ in the S. iniae, S. parauberis and V. anguillarum respectively while the minimum bacterial concentration (MBC) were found to be 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖ for S. iniae, S. parauberis and V. anguillarum
Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences of the strain MK-01 shows the high similarity to Streptomyces carpaticus (97.63%).
DPPH radical scavenging activity of different methnol fraction of MK-01 culture showed 31.25㎍/㎖ for 13%, 62.5㎍/㎖ for 15%,, 125㎍/㎖ for 19%, 250㎍/㎖ for 22%, 500㎍/㎖ for 23% and 1000㎍/㎖ for 29% and Ethyl acetate fraction showed 31.25㎍/㎖ for 9%, 62.5㎍/㎖ for 11%,, 125㎍/㎖ for 19%, 250㎍/㎖ for 20%, 500㎍/㎖ for 21.12% and 1000㎍/㎖ for 26% Hydroxyl radical scavenging activity for methnol fraction showed 31.25㎍/㎖ for 13%, 62.5㎍/㎖ for 16.68%,, 125㎍/㎖ for 23.87%, 250㎍/㎖ for 38.2%, 500㎍/㎖ for 42.9% and 1000㎍/㎖ for 58.8% and for Ethyl acetate fraction showed 31.25㎍/㎖ for 9.32%, 62.5㎍/㎖ for 14.68%,, 125㎍/㎖ for 20.78%, 250㎍/㎖ for 29.2%, 500㎍/㎖ for 39.8% and 1000㎍/㎖ for 49.9%
Dietary effect of MK-01 supernatant on non-specific immune response such as Lysozyme activity and Phagocytic activity of Olive flounder was assessed with 3% of supernatant mixed flounder feed.
Author(s)
김민선
Issued Date
2014
Awarded Date
2015. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006967
Alternative Author(s)
Min-Seon Kim
Department
대학원 해양생명과학과
Table Of Contents
Ⅰ. 서 론 1

Ⅱ. 재료 및 방법 2

2.1. 해양 유래 방선균 분리 및 균주 선정 5
2.1.1. 균주 분리 5

2.2. 분리 방선균의 형태학적 및 생화학적 동정 7
2.2.1. 그람염색(Gram staining) 7
2.2.2. Casein hydrolysis test 7
2.2.3. Starch hydrolysis test 8
2.2.4. Urease hydrolysis test 8
2.2.5. Catalase test 9
2.2.6. Nitrate reduction test 9
2.2.7. Gelatin hydrolysis test 10
2.2.8. Cellulose hydrolysis test 11
2.2.9. Hemicellulose hydrolysis test 11
2.2.10. Tween 20, 80 hydrolysis test 12
2.2.11. Chitin hydrolysis test 12
2.2.12. hemolysis test 13

2.3. 항균작용을 갖는 방선균의 분리 14
2.3.1. 어류질병균주에 대한 항균활성 탐색 14

2.4. 선발균주의 형태학적 및 생화학적 2차 스크리닝 15
2.4.1. SEM (Scanning electron microscope) 15
2.4.2. 선발균주의 탄수화물 대사능 및 효소활성 실험 15
2.4.3. 선발균주의 16S rRNA 염기서열 분석 16

2.5. Streptomyces carpaticus MK-01의 최적 배양조건과 항균활성 측정 17
2.5.1. 온도별 최적배양조건 탐색 및 항균활성 측정 17
2.5.2. pH별 최적배양조건 탐색 및 항균활성 측정 17
2.5.3. NaCl 첨가별 최적배양조건 탐색 및 항균활성 측정 17
2.5.4. 탄소원 배지조성에 따른 생육검토 및 항균활성 측정 18
2.5.5. 질소원 배지조성에 따른 생육검토 및 항균활성 측정 19
2.5.6. 무기염 배지조성에 따른 생육검토 및 항균활성 측정 19

2.6. Streptomyces carpaticus MK-01의 분획물의 항균활성 평가 20
2.6.1. 유기용매 분획 20
2.6.2. 최소억제농도(MIC) 측정 20
2.6.3. 최소살균농도(MBC) 측정 21

2.7. Streptomyces carpaticus MK-01의 분획물의 항산화 활성 측정 21
2.7.1. Hydroxyl radical 소거활성 21
2.7.2. DPPH radical 소거활성 22

2.8. Streptomyces carpaticus MK-01의 농도별 사료 첨가에 따른 양식넙치의 비특이적 면역반응 실험 23
2.8.1. 실험어 사육관리 23
2.8.2. 혼합 사료 제작 및 투여 24
2.8.3. Lysozyme activity 24
2.8.4. Phagocytosis activity 24


Ⅲ. 결과 및 고찰 25

3.1. 해양 유래 방선균 분리 25

3.2. 분리 방선균의 배양학적 특성 25

3.3. 분리 방선균의 형태학적 및 생화학적 동정 27

3.4. 어류 질병 세균에 대한 항균활성 결과 30
3.4.1. 항균물질 생산 방선균주 선정 30

3.5. 선발균주 MK-01의 형태학적·생화학적 2차 스크리닝 32
3.5.1. MK-01의 Scanning electron microscope 33
3.5.2. MK-01의 탄수화물 대사능 및 효소 활성 33
3.5.3. 16S rRNA염기서열 분석 36

3.6. Streptomyces carpaticus MK-01의 최적배양조건 탐색 및 항균활성 측정 37
3.6.1. 온도별 최적 배양조건 탐색 및 항균활성 37
3.6.2. pH별 최적 배양조건 탐색 및 항균활성 38
3.6.3. NaCl첨가별 최적 배양조건 탐색 및 항균활성 39
3.6.4. 탄소원 배지조성에 따른 생육 검토 및 항균활성 40
3.6.5. 질소원 배지조성에 따른 생육 검토 및 항균활성 41
3.6.6. 무기염 배지조성에 따른 생육 검토 및 항균활성 42

3.7. Streptomyces carpaticus MK-01 분획물의 항균활성 평가 43
3.7.1. 최소억제농도(MIC) 43
3.7.2. 최소살균농도(MBC) 44

3.8. Streptomyces carpaticus MK-01 분획물의 항산화 활성 측정 45
3.8.1. Hydroxyl radical 소거활성 45
3.8.2. DPPH radical 소거활성 46

3.9. Streptomyces carpaticus MK-01의 농도별 사료 첨가에 따른 양식넙치의 비특이적 면역반응 실험 47
3.9.1. Lysozyme activity 47
3.9.2. Phagocytosis activity 48

Ⅳ. 요 약 50


Ⅴ. 참고 문헌 53

Ⅵ. 감사의 글 58
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김민선. (2014). 제주 연안에서 분리한 해양유래 방선균 Streptomyces carpaticus MK-01의 형태학적·생화학적 동정 및 어류질병균주에 대한 항균활성탐색
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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